兔源抗氧化肽的Keap1结合潜力解析：构效关系、作用机制及多模型评价

本研究发现木瓜蛋白酶水解兔肉蛋白产生的活性肽（PH3-F5组分）具有卓越的抗氧化性能，其通过直接清除自由基（DPPH/ABTS）和调控Keap1-Nrf2-ARE通路双重机制发挥作用。量子化学计算揭示芳香族氨基酸（Trp/Tyr）通过氢原子转移（HAT）和电子转移（ET）机制主导抗氧化活性，斑马鱼模型证实其可降低ROS水平并恢复SOD、CAT活性。该研究为功能性食品开发提供了新型天然抗氧化剂候选分子。

　　

研究亮点

兔肉蛋白经七种蛋白酶水解后，木瓜蛋白酶水解物展现出最强自由基清除能力（DPPH 51.50%，ABTS 61.50%）。超滤及Sephadex G-15层析鉴定出<3 kDa组分（PH3）及其亚组分F5具有卓越抗氧化活性。LC-MS/MS从F5中鉴定出163种肽段，其中56种通过PeptideRanker和AnOxPePred算法预测具抗氧化潜力。7种新型肽段与Keap1结合能<-8.0 kcal/mol，表明可能通过Keap1-Nrf2通路调控抗氧化反应。

材料

新西兰白兔肉购自重庆本地超市，碱性蛋白酶购自麦克林生化，DPPH、ABTS等试剂购自上海源叶生物。所有化学品均为分析纯。

制备具有最佳抗氧化活性的兔肉蛋白水解物（RMH）

通过七种蛋白酶（菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）水解兔肉蛋白，其中木瓜蛋白酶水解物在DPPH和ABTS清除实验中表现最优，其<3 kDa超滤组分（PH3）及凝胶过滤亚组分F5抗氧化活性最为显著。F5中短肽（尤其是三肽）占主导，经LC-MS/MS鉴定出163种肽段。

结论

木瓜蛋白酶水解产生的GPWLQ、PAPW和PGAPW等肽段具有双自由基清除能力，量子化学分析表明其最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）能隙较小，芳香族残基（Trp/Tyr）通过电子捐赠机制发挥关键作用。分子对接证实这些肽段与Keap1 Kelch结构域稳定结合，斑马鱼实验验证其可降低ROS水平并恢复SOD、CAT活性。

作者贡献声明

杨万州：原始稿撰写、数据整理；台志远等：方法学支持；何奇益：综述修订与课题设计。

利益冲突声明

作者声明无已知竞争性经济利益。

致谢

本研究由重庆市林业改革发展资金（渝林科推2019-2）和重庆师范大学基金（19XLB006）资助。