肉汤增菌直肠拭子中免疫层析试验验证：快速检测碳青霉烯酶产生肠杆菌的新策略

本研究针对碳青霉烯酶产生肠杆菌(CPE)感染防控中快速检测的迫切需求，开发了基于O.K.N.V.I. RESIST-5免疫层析试验(ICT)的肉汤增菌直接检测方案。研究人员通过模拟直肠拭子样本验证，发现在不含美罗培南的BHI肉汤中培养6小时后，对KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP五种碳青霉烯酶的检测均达到100%灵敏度、特异性和准确度。该方案为CPE筛查提供了较培养方法更快速(6h vs 48-72h)、较分子检测更经济的实用替代方案，对加强感染控制具有重要意义。

　　

在抗菌药物耐药性(AMR)日益严重的全球公共卫生危机中，碳青霉烯酶产生肠杆菌(CPE)的传播尤为令人担忧。这些超级细菌能够水解碳青霉烯类药物——通常被视为治疗多重耐药菌感染的最后防线，其出现和扩散导致患者住院时间延长、发病率和死亡率上升以及医疗成本增加。美国疾病控制与预防中心(CDC)已将碳青霉烯耐药肠杆菌(CRE)列为紧迫的公共卫生威胁，世界卫生组织(WHO)也在其细菌病原体优先级清单中将CRE列为关键的AMR公共卫生威胁。

控制CPE传播的核心策略在于及时识别和隔离定植或感染患者，但这高度依赖于实验室的快速准确检测。传统培养方法虽然可靠，但耗时长达48-72小时，且只能检测耐药性而无法识别具体的碳青霉酶类型。分子检测方法如聚合酶链反应(PCR)虽能快速检测特定基因，但成本高昂且无法区分基因是否存在表达，在资源有限 settings 中推广应用面临挑战。

免疫层析试验(ICT)作为一种快速检测技术，通过侧流抗原-抗体反应检测碳青霉烯酶，具有操作简便、成本较低的优势。然而，现有ICT产品主要设计用于纯菌落检测，而非直接临床样本。能否开发一种基于ICT的直接检测方案，在保证准确性的前提下大幅缩短检测时间，成为感染控制领域亟待解决的问题。

为此，研究团队在《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》上发表了一项创新性研究，开发并验证了直接从肉汤增菌直肠拭子中检测五种常见碳青霉烯酶(KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP)的ICT方案。他们使用来自LIM-49收藏和美国CDC＆FDA抗菌药物耐药性分离株库的35个明确表征的CPE分离株创建模拟直肠拭子，通过在脑心浸液(BHI)肉汤中培养4小时和6小时(含或不含美罗培南磁盘)，比较了不同条件的检测性能。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先使用全基因组测序(WGS)对分离株进行基因型表征作为金标准；通过矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序进行菌株鉴定；采用参考肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验(AST)；使用10%粪便基质创建模拟临床样本环境；并通过极限检测(LOD)实验确定检测灵敏度。

验证纯分离株性能时，研究人员发现所有ICT结果与预期结果一致，仅一株NDM产生阴沟肠杆菌初始测试为假阴性，但在血琼脂上重复培养后转为阳性，最终达到100%一致性。

在模拟直肠拭子检测中，最佳性能出现在不含美罗培南的BHI肉汤中培养6小时的条件下，对所有五种酶的检测均显示出100%灵敏度、特异性和准确度。含美罗培南或较短培养时间的条件下灵敏度较低，各酶灵敏度范围从0%到100%不等。值得注意的是，不含美罗培南的肉汤在各时间段均表现出相当于或优于含美罗培南肉汤的ICT性能。

延长培养时间至6小时也改善了性能，且与美罗培南存在与否无关。ICT对IMP和VIM酶在所有肉汤条件下表现较差，唯独在6小时无美罗培南培养条件下显示良好结果。

对三种NDM/OXA-48双酶产生菌的研究发现，在6小时培养期间，无论是否存在美罗培南，均能100%灵敏度地同时检测到两种酶。而在4小时培养期间，仅在一株分离株中同时检测到两种酶。

七例插入Stuart凝胶培养基的拭子中，五例在所有条件下均为阳性，一例KPC在4HM条件下未检测到，仅6小时无美罗培南方案正确识别了IMP酶的存在。

极限检测(LOD)分析显示，O.K.N.V.I.的总体LOD为1.125×10⁵ CFU，其中KPC和OXA-48靶点的LOD较低，为1.125×10⁴ CFU。

方法学优化过程中，研究人员发现硫乙醇酸盐肉汤离心后形成难以吸取的厚沉淀，而延长培养至24小时则导致18例假阳性，pH值降至酸性范围(5-6)，推测是因粪便基质积累酸性副产物导致ICT假阳性结果。这些发现促使团队最终选择BHI无美罗培南培养4小时和6小时方案。

研究结论表明，开发的新方案能够在6小时内直接从肉汤增菌直肠拭子中快速准确地检测五种常见碳青霉烯酶，且在不含美罗培南的条件下培养6小时可获得最佳性能。这一发现挑战了传统认知——通常认为在 enrichment broth 中添加抗生素可抑制敏感菌生长而增强目标菌检测。

讨论部分强调，该协议较培养方法显著缩短了检测周转时间(TAT)，使感染预防控制(IPC)措施能够更快实施，从而有效控制CPE传播。与分子方法相比，ICT不仅成本更低，还能确认酶的实际产生而不仅仅是基因存在，且不需要特殊设备。然而，该技术只能检测其靶 panel 中包含的碳青霉烯酶，这是其重要局限性。

该研究的实际意义在于为医疗 settings，特别是资源有限地区，提供了一种实用、快速且经济的CPE筛查替代方案。通过及时识别定植患者和特定碳青霉酶类型，IPC团队可以实施更有针对性的干预措施，如对检测到非本地流行酶型的患者启动接触者筛查等额外应对活动。

需要注意的是，该研究的性能评估仅限于测试的基因变异体，无法推广到其他变异体。且使用的模拟直肠拭子引入了一定的人为性，可能影响与真实临床样本相比的性能结果。这些限制突显了需要进行更大规模研究以验证结果并增强统计置信度的必要性。