CD133过表达与TGF-β协同作用构建三维卵巢癌球体模型及其在肿瘤发生与治疗中的应用研究

本研究针对卵巢癌(OC)化疗耐药与复发难题，通过构建CD133过表达与TGF-β补充的CAF整合三维球体模型，成功模拟了肿瘤微环境(TME)中癌症干细胞(CSC)特性。研究发现该模型显著增强肿瘤发生性、细胞因子介导的侵袭性和化疗耐药性，并揭示PAR1/CXCR4/PD-L1信号轴激活机制。工程化PAR1CAR-T细胞对耐药OC球体展现显著细胞毒性，为卵巢癌靶向治疗提供了新型实验平台和治疗策略。

　　

卵巢癌作为致死率最高的妇科恶性肿瘤，长期以来面临化疗耐药和肿瘤复发的临床挑战。癌症干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)理论为这一难题提供了新的解释视角——这群具有自我更新能力和治疗抵抗特性的细胞群体被认为是肿瘤复发和转移的根源。然而，传统二维细胞培养模型无法真实模拟肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的复杂性，特别是缺乏癌症相关成纤维细胞(Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs)等基质细胞的参与，导致研究成果向临床转化存在巨大障碍。

在这一研究背景下，Hao-Chien Hung、Tsui-Lien Mao等研究人员在《Cells》上发表了一项创新性研究，通过建立CD133过表达与TGF-β补充相结合的三维球体培养模型，成功构建了能够准确模拟晚期卵巢癌特征的实验平台。该研究不仅深入探讨了CD133与TGF-β在卵巢癌肿瘤发生中的协同作用机制，还为开发新型治疗策略提供了重要依据。

研究人员采用多项关键技术方法：通过慢病毒转染实现CD133基因过表达；建立CAF与卵巢癌细胞共培养的三维球体模型；利用Transwell实验评估细胞侵袭能力；采用RNA测序进行基因本体(Gene Ontology, GO)和KEGG通路富集分析；通过流式细胞术检测表面标志物表达；使用ELISA法检测细胞因子分泌；构建靶向PAR1、PD-1/PD-L1的CAR-T细胞并进行体外细胞毒性测试；建立裸鼠皮下移植瘤模型进行体内验证。所有细胞系均经过STR鉴定和质量控制。

3.1. 具有癌症干细胞(CSC)特性的球体形成OC和CAF细胞的建立

研究人员通过绿色荧光蛋白(GFP)转染的卵巢癌细胞(SKOV3和OVCAR8)单独或与CAF共培养，在生长因子(胰岛素、EGF、β-FGF和LIF)诱导下形成球体。结果显示，与CAF共培养的OC球体(SKOV3/OVCAR8-CAF-spheres)从第8天开始表现出显著增强的CD133水平和细胞倍增变化。到第16天，细胞倍增增加至34-35倍，且CD133⁺细胞比例在SKOV3和OVCAR8球体中分别从22.4%升至55.2%和从0.3%升至15.5%，表明CAF整合创造了支持干细胞特性的微环境。

3.2. 三维多细胞培养条件通过微环境中的细胞因子增强OC球体的致瘤性和侵袭性

Transwell侵袭实验显示，三维条件下的平均细胞数量显著高于二维条件。ELISA分析表明，CAF整合的OC球体在三维多细胞培养条件下TGF-β和TNF-α表达显著高于其他组。特别值得注意的是，CAF共培养的OC球体在三维培养条件下细胞因子表达出现额外显著增加，表明CAF不仅作为肿瘤样生态位细胞与癌细胞相互作用，还为形成功能性三维肿瘤球体提供空间结构支持。

3.3. 三维OC球体中获得性化疗耐药

研究通过用顺铂(CDDP)和紫杉醇(PTX)联合预处理亲代OC细胞1、5和9天，随后进行4天三维球体培养，成功建立了化疗耐药OC球体(SKOV3-cr-sp和OVCAR8-cr-sp)。MTT法检测显示，延长预处理时间导致三维球体中化疗耐药性剂量依赖性增加。IC₅₀值分析表明，在三维培养条件下，CDDP和PTX的IC₅₀值随预处理时间延长而增加：1天(1.4μM和1.4nM)、5天(1.8μM和1.8nM)和9天(2.2μM和2.2nM)，而二维培养条件下的值较低，表明培养时间延长和三维条件与两种药物的IC₅₀值增加正相关。

3.4. 已建立皮下OVCAR8球体移植瘤的体内生长及肿瘤发生相关标志物

通过皮下注射6×10⁷个细胞建立裸鼠移植瘤模型，分为四组：OVCAR8亲代(p)、OVCAR8球体(sp)、OVCAR8-p/CAF-p和OVCAR8-sp/CAF-sp。结果显示，OVCAR8-sp/CAF-sp组肿瘤质量显著大于其他组。组织学检查显示，OVCAR8-sp/CAF-sp组肿瘤中PAR1、细胞周期蛋白D1、整合素β4(ITGB4)、整合素αvβ6、纤连蛋白、CD133、OCT4、Nanog和PD-L1等促肿瘤生物标志物阳性染色数/场显著高于其他组，表明三维培养下CAF整合的OC球体移植瘤模型表现出适当的干细胞特征和完整的肿瘤发生相关标志物。

3.5. TGF-β和CD133增强PAR1、CXCR4和PD-L1表达的机制验证

通过将CD133基因转入SKOV3细胞(SKOV3-CD133)并在三维模型中形成球体(SKOV-CD133-sp)，进行mRNA测序分析。GO和KEGG通路富集分析显示，"PI3K-Akt信号通路"、"Focal adhesion"、"ECM-receptor interaction"和"IL-17信号通路"是最主要的富集类别。ELISA分析表明，CD133转导和TGF-β处理的SKOV3细胞中TGF-β和TNF-α水平显著升高。流式细胞术显示，用1ng/mL TGF-β处理并结合CD133转导的SKOV3细胞中PAR1(从23.9%升至77.9%)、CXCR4(从15.4%升至54.5%)和PD-L1(从18.9%升至63.1%)表达显著高于亲代细胞，表明TNF-α可能通过多种TGF-β驱动的信号通路正向调节PAR1、CXCR4和PD-L1。

3.6. PAR1CAR-T和PD1/PD-L1-CAR-T细胞对化疗耐药OC球体的体外细胞毒性

研究首先创建了化疗耐药OC球体，结果显示CDDP、PTX及其组合在48小时处理后仅产生约20%的细胞毒性，而对SKOV3-CD133+CAFs没有显示细胞毒性活性，可能是由于干细胞微环境的增强。PAR1CAR-T细胞与OVCAR8+CAF和SKOV3+CAF细胞以效应器与肿瘤(E/T)比率1、5和15共培养，结果显示PAR1CAR-T细胞对OVCAR3+CAF和SKOV3+CAF具有相对显著的细胞毒性活性。特别值得注意的是，PAR1CAR-T细胞对与CAFs共培养的CD133过表达SKOV3(SKOV3-CD133+CAFs)以及添加1ng/mL TGF-β的SKOV3-CD133+CAFs也表现出强大的细胞毒性。对于另一种肿瘤抗原PD-L1，PD1ACR-T和PDL1CAR-T细胞即使在低E/T比率1下也能快速消除SKOV3-CD133+CAF细胞和SKOV3-CD133+CAF+1ng/mL TGF-β细胞，而非转导的CD3 T细胞(模拟对照)没有产生细胞毒性事件。

研究结论与讨论部分强调，该研究建立的CD133-OC球体三维培养系统成功重现了晚期卵巢癌进展的真实环境，能够有效进行机制验证的实验。这一平台作为研究卵巢癌化疗、免疫治疗和细胞治疗的有用工具，CD133-OC球体表现出合理且实用的干细胞特性，能够在移植瘤中模拟肿瘤生长。研究还发现，CD133与TGF-β协同作用通过多种机制促进卵巢癌进展，包括激活PI3K-Akt等关键信号通路，上调PAR1、CXCR4和PD-L1等肿瘤相关抗原表达。工程化CAR-T细胞针对这些靶点展现出的显著细胞毒性，为克服卵巢癌化疗耐药提供了新的治疗方向。该模型不仅为卵巢癌生物学研究提供了更接近生理条件的实验平台，而且为开发针对癌症干细胞和肿瘤微环境的联合治疗策略奠定了重要基础。