通过基因工程和适应性进化改良酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以实现高效的木糖吸收和乙醇生产

《Chinese Journal of Chemical Engineering》：Genetic engineering and adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae for robust xylose uptake and ethanol production

利用基因工程和适应性进化策略，对酿酒酵母SPSC01-TAF94进行改造，过表达木糖转运和代谢相关基因（如N360F、Ru-xylA等），并通过三阶段适应性进化处理含5 g/L乙酸、0.32 g/L糠醛等抑制剂的玉米秸秆水解液，获得乙醇产量达44.9 g/L的高效菌株TAF94-X60，显著提升木糖利用效率及乙醇产率。

　　在当前的生物能源研究中，木质纤维素生物乙醇的生产被视为实现碳中和、提高能源安全以及推动可持续发展的重要途径。由于木质纤维素原料中富含多种糖类，包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖等，其中木糖作为第二主要成分，其高效利用对提升整体乙醇产量具有重要意义。然而，自然状态下的酵母菌株，如酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*），虽然能够高效代谢葡萄糖，却无法直接利用木糖作为碳源。此外，在含有木质纤维素预处理副产物抑制剂的发酵体系中，木糖的利用率、乙醇产率以及发酵效率均受到显著影响。因此，如何在不经过传统脱毒或水洗处理的情况下，实现酵母对木糖的高效转化，成为研究的关键。

为了解决这一问题，科学家们提出了多种策略，其中遗传工程与适应性进化相结合的方式被广泛认为是极具潜力的解决方案。遗传工程可以通过调控关键基因的表达，提高酵母对木糖的摄取与代谢能力；而适应性进化则是在实际发酵条件下，通过长期培养和筛选，使酵母逐渐适应抑制剂环境，从而提升其生存能力与代谢效率。在本研究中，研究人员基于已开发的耐受性强的酵母菌株 SPSC01-TAF94，通过遗传工程手段过表达与木糖运输和代谢相关的多个基因，如 *N360F, Ru-xylA, TAL1, TKL1, RKI1* 和 *RPE1*，从而构建出一个初步具备木糖利用能力的菌株 TAF94-X。随后，该菌株在含有不同浓度木糖的非脱毒玉米秸秆水解液中进行三阶段适应性进化，进一步提升其在抑制剂存在下的木糖利用效率和乙醇产率。

研究结果显示，经过三阶段适应性进化的菌株 TAF94-X60，在非脱毒水解液中表现出显著的乙醇产率和木糖利用能力。在实验条件下，该菌株能够实现 44.9 g·L?1 的乙醇产量，其产率达到 0.41 g·g?1，单位时间的乙醇生产速率为 0.62 g·L?1·h?1，同时木糖的消耗速率达到 0.42 g·L?1·h?1。这些数值明显优于对照菌株 TAF94-X 的表现，后者在相同条件下分别达到了 36.5 g·L?1、0.38 g·g?1、0.50 g·L?1·h?1 和 0.20 g·L?1·h?1。这意味着，通过遗传工程与适应性进化相结合的方式，可以有效提升酵母在复杂木质纤维素水解液中的性能，同时避免传统脱毒或水洗步骤，从而显著降低生产成本，提高大规模生产的经济可行性。

在实际应用中，木质纤维素原料的水解过程通常会产生多种抑制物，如乙酸、糠醛、二氢愈创木糖（HMF）和香草醛等。这些抑制物会干扰酵母的代谢活动，降低其对木糖的利用效率，甚至影响其生长。因此，如何提高酵母对这些抑制物的耐受性，成为实现高效木质纤维素乙醇生产的重要挑战。在本研究中，研究人员通过基因工程手段，过表达与木糖运输和代谢相关的基因，同时通过适应性进化，使菌株在实际发酵条件下逐步适应这些抑制物的存在。这种双重策略不仅提升了酵母的代谢能力，还增强了其对抑制物的耐受性，从而实现更高效的木糖转化。

此外，木糖的代谢途径主要包括木糖还原酶-木糖醇脱氢酶（XR-XDH）途径和木糖异构酶（XI）途径。XR-XDH 途径需要 NADPH 作为辅因子，而 XDH 则依赖 NAD? 进行反应，这种辅因子的不平衡限制了 XR-XDH 途径的效率。相比之下，XI 途径则直接将木糖转化为果糖，从而绕过辅因子的限制，提高代谢效率。然而，XI 途径在某些情况下也受到限制，例如，其对木糖的利用效率可能受到其他代谢途径的干扰。因此，如何优化木糖代谢途径，提高酵母对木糖的利用效率，成为研究的重点。

在本研究中，研究人员通过过表达 *Ru-xylA* 基因，引入来自 *Clostridium phytofermentans* 的优化木糖异构酶基因，以提高木糖的利用效率。这一策略使得酵母能够更高效地将木糖转化为乙醇，同时减少对其他糖类的依赖。此外，研究人员还通过过表达 *TAL1, TKL1, RKI1* 和 *RPE1* 等基因，进一步优化木糖的代谢过程，提高其转化效率。通过这些基因工程手段，构建出的菌株 TAF94-X 在木糖利用方面表现出良好的性能，为后续的适应性进化奠定了基础。

在适应性进化过程中，研究人员将 TAF94-X 菌株置于含有不同浓度木糖的非脱毒水解液中，进行三段式培养。第一阶段，菌株在含有 20 g·L?1 木糖的水解液中培养，以适应木糖的存在；第二阶段，将木糖浓度提升至 40 g·L?1，进一步优化菌株的代谢能力；第三阶段，则将木糖浓度提升至 60 g·L?1，以评估菌株在高浓度木糖环境下的表现。通过这一过程，菌株逐渐适应了木糖的存在，并在抑制物环境中展现出更高的代谢效率和乙醇产率。

适应性进化不仅能够提升酵母的代谢能力，还能增强其对抑制物的耐受性。在实验中，研究人员发现，经过适应性进化的菌株 TAF94-X60 在含有 5 g·L?1 乙酸、0.32 g·L?1 糠醛、0.17 g·L?1 HMF 和 0.19 g·L?1 香草醛的水解液中，能够实现更高的乙醇产量和木糖利用效率。这些结果表明，适应性进化能够有效提升酵母在复杂环境中的生存能力，使其在不经过脱毒处理的情况下，仍能高效利用木糖进行乙醇生产。

本研究的成果不仅为木质纤维素乙醇生产提供了新的思路，也为生物燃料产业的发展提供了技术支持。通过遗传工程与适应性进化相结合的方式，研究人员成功构建出一个能够在非脱毒水解液中高效利用木糖并产生乙醇的菌株，为大规模生产提供了更经济、更可持续的解决方案。这一研究强调了基因工程与适应性进化在提升酵母性能方面的协同效应，为未来的研究和应用提供了重要的参考价值。

在实际应用中，这种新型菌株的开发不仅有助于提高木质纤维素乙醇的生产效率，还能够减少对传统脱毒或水洗处理的依赖，从而降低生产成本，提高经济效益。此外，由于木质纤维素原料的来源广泛，包括农业废弃物、林业残余物和能源作物等，这种菌株的应用具有广阔的前景。通过进一步优化和推广，这种菌株有望成为生物燃料产业中的关键工具，推动可持续能源的发展。

综上所述，本研究通过基因工程与适应性进化相结合的方式，成功提升了酵母在非脱毒木质纤维素水解液中的木糖利用效率和乙醇产率。这一成果不仅为生物乙醇生产提供了新的技术路径，也为未来的研究和应用提供了重要的参考价值。随着生物燃料产业的不断发展，木质纤维素乙醇的生产将越来越受到人们的关注，而这种高效利用木糖的酵母菌株无疑将在其中发挥重要作用。