普通小球藻蛋白分离物在加工、储存和体外消化过程中有效保护鼠李糖乳杆菌GG的活性：微藻蛋白作为益生菌稳定剂的潜力研究

本研究针对益生菌在加工、储存和胃肠道环境中的活性保护难题，创新性地利用普通小球藻蛋白分离物（CPI）作为壁材，通过冻干技术制备含鼠李糖乳杆菌GG（LGG）的益生菌粉末。研究发现CPI能有效维持LGG在冻干、不同温湿度储存及体外消化过程中的高存活率（>4 log CFU g-1），并促进肠道粘附，为替代传统乳蛋白开发可持续、非致敏性益生菌制剂提供了新策略。

　　

益生菌作为维持肠道健康乃至全身健康的重要微生物，其市场需求日益增长。然而，益生菌产品面临着一个核心挑战：这些活菌在食品加工、储存以及通过人体胃肠道的过程中极易失活。常见的保护策略包括将益生菌封装在由蛋白质、多糖等构成的微胶囊中，其中乳清蛋白、酪蛋白等乳源蛋白因具有良好的保护效果而被广泛应用。但乳蛋白存在致敏性、不符合素食需求以及环境可持续性等问题。因此，开发新型、可持续、非致敏性的植物或替代蛋白来源作为益生菌的保护载体，成为食品科学与营养健康领域的研究热点。

微藻，作为一种单细胞光合微生物，正因其高蛋白含量和丰富的营养 profile 而受到青睐。其中，普通小球藻（Chlorella vulgaris）的蛋白质含量可高达干重的67%，且其氨基酸组成均衡，消化率高，具备出色的乳化性和凝胶特性，是一种极具潜力的新型植物蛋白资源。此前的研究表明，微藻生物质本身对乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌具有保护作用，但将其提取出的蛋白分离物（Chlorella vulgaris Protein Isolate, CPI）系统性地用于保护益生菌，并深入探究其在整个产品生命周期（从加工到消费后消化）中的作用，仍属空白。

为了回答利用微藻蛋白能否有效保护益生菌这一科学问题，来自卢森堡科学技术研究所（Luxembourg Institute of Science and Technology, LIST）的Jennyfer Fortuin、Christos Soukoulis等研究人员开展了一项细致的研究。他们的研究成果发表在《Food Hydrocolloids》上，论文标题为“Chlorella vulgaris Protein Isolate Effectively Protects Lacticaseibacillus rhamnosus GG Viability During Processing, Storage, and in vitro Digestion”。

研究人员首先从普通小球藻生物质中提取并纯化了CPI，其蛋白质含量高达86.8%。随后，他们将CPI与麦芽糊精、海藻糖和葡萄糖等冻干保护剂混合，制备成悬浮液，并接种入著名的益生菌菌株——鼠李糖乳杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）。为了探究益生菌预处理的影响，研究团队设置了两组样品：一组是未经过预发酵的悬浮液（CNT），另一组则利用LGG自身将悬浮液发酵至pH 4.5（CF），以模拟一种预适应过程。之后，将所有样品进行冷冻干燥，制成益生菌粉末。

为开展研究，作者团队运用了多项关键技术方法。研究采用了静态体外消化模型（INFOGEST v2.0）来模拟人体口腔、胃和肠道的消化环境，以评估益生菌的存活情况。通过扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察了益生菌粉末的微观结构以及细菌在消化过程中的分布与存活状态（采用Live/Dead染色）。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了蛋白质的二级结构。采用动态水分吸附分析（DVS）并结合Guggenheim-Anderson-de Boer (GAB)模型研究了粉末的吸湿特性。通过热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）测定了样品的热稳定性与玻璃化转变温度（T_g）。使用毛细管SDS-PAGE和纳米液相色谱-质谱联用（nano-LC-MS/MS）进行了蛋白质组学和肽组学分析，以追踪消化过程中蛋白质的水解情况。最后，利用Caco-2/HT29-MTX细胞共培养模型来评估LGG细胞在体外肠道模型上的粘附能力。

3.1. 益生菌粉末的理化特性、微观结构和热学特性

研究人员首先对制备的益生菌粉末进行了全面的表征。FTIR分析显示，CPI的蛋白质二级结构主要以α-螺旋（68–75%）为主，其次是β-折叠（20–27%）和聚集链（3–5%），发酵预处理（CF）并未显著改变这一结构。扫描电镜（SEM）图像显示，所有粉末均呈现致密、片状、多孔的形态，但CF样品的孔隙更大，这被归因于发酵过程中在蛋白质等电点附近形成的酸诱导蛋白质聚集凝胶网络。水分吸附分析表明，所有样品均呈现II-III型混合等温线，CF样品在单层水结合方面表现出更松散的特性（Guggenheim常数C值更低）。热分析显示，CPI益生菌粉末的玻璃化转变温度（T_g）较高（干燥状态下DSC测定约为111°C），发酵处理对其热塑性没有显著影响。

3.2. 体外消化过程中的胶体变化

通过激光共聚焦显微镜（CLSM）和静态光散射（SLS）追踪消化过程发现，在口腔阶段，粉末迅速崩解并释放出LGG细胞。在胃消化阶段，CPI基质发生酸诱导聚集，形成了包裹益生菌的颗粒，这为LGG提供了良好的保护，使其免受低pH和胃蛋白酶的攻击。CF样品在胃消化后显示出更大的颗粒尺寸，表明其结构更不易被胃环境破坏。进入肠道阶段后，在胰酶和胆汁盐的作用下，蛋白质聚集体被有效分解，颗粒尺寸减小。

3.3. 体外胃肠道消化物的蛋白质组学和肽组学分析

毛细管SDS-PAGE和nano-LC-MS/MS分析揭示了消化过程中蛋白质的详细水解过程。未消化时，CPI中的主要蛋白质是核糖体蛋白（52-63%）和分子伴侣（5.9-11.5%）。胃消化后，蛋白质被广泛水解。到肠道消化结束时，水解度（DH）高达83-87%。肽组学分析显示，CF样品在消化前就含有更多短肽，这表明预发酵启动了蛋白质的预水解。尽管如此，经过完整的胃肠道消化后，两种处理（CNT与CF）最终的肽段分布差异变得不显著。

3.5. LGG在加工、储存和体外消化过程中的存活率

这是研究的核心发现。冻干过程：CPI展现了优异的冻干保护效果，LGG的存活率极高（~10 log CFU g^-1），CF样品的冻干损失略高于CNT样品。储存稳定性：研究在多种温湿度条件下（4°C/11% RH, 20°C/11% RH, 37°C/11% RH, 20°C/75% RH）评估了储存稳定性。正如预期，高温高湿条件会加速菌株失活。在20°C和11% RH的最佳储存条件下，CNT和CF样品的预测保质期分别为294天和79天。CF样品保质期较短，推测是由于发酵过程对细胞膜造成了一定的亚致死损伤，使其对后续应激更敏感。体外消化存活率：游离的LGG在模拟胃肠消化中存活率极低（胃部损失2.8 log，肠道损失3.1 log）。而嵌入CPI基质的LGG受到了显著保护。在胃消化阶段，CNT和CF的LGG损失分别为1.3和1.8 log CFU g^-1。令人惊讶的是，在肠道消化阶段，LGG的存活率不仅没有下降，CF样品中的活菌数甚至略有上升。研究人员推测，这可能是由于LGG表达了胆汁盐水解酶（BSH），能够利用胆汁盐作为营养源，从而在肠道环境中实现微小的生长。

3.6. LGG在体外肠上皮的粘附情况

使用Caco-2/HT29-MTX共培养模型评估了消化后存活下来的LGG的粘附能力。结果表明，从CPI基质中释放出来的LGG能够有效地粘附到肠道黏液层上，粘附量超过4 log CFU cm^-2，达到了益生菌发挥功能所需的水平。CF样品的粘附量略低于CNT，可能与发酵过程改变了细菌表面的粘附素或胞外多糖（EPS）有关。

综上所述，本研究得出明确结论：从普通小球藻中提取的蛋白分离物（CPI）是一种非常有效的益生菌保护剂和递送载体。它能在冷冻干燥、长期储存以及严苛的胃肠道环境中有效地维持鼠李糖乳杆菌GG（LGG）的高存活率。虽然对悬浮液进行预发酵（CF）会略微降低LGG在储存期间的稳定性，但它可能增强了菌株对肠道胆汁盐环境的适应性。最终，经CPI保护的LGG能够成功抵达肠道并有效粘附于肠上皮细胞。

该研究的重要意义在于：首先，它成功验证了微藻蛋白作为乳蛋白替代品用于功能性食品开发的巨大潜力，为开发非致敏性、可持续的素食益生菌产品提供了坚实的科学依据和技术方案。其次，研究不仅关注加工环节，还系统评估了从生产到消费（消化）的全过程，提供了对CPI保护机制的深入理解，特别是在消化过程中CPI基质的动态变化及其对益生菌的保护作用。最后，研究发现经消化后LGG的肠道粘附性良好，暗示了其定殖和发挥益生功能的潜力，为后续开发基于微藻蛋白的新型益生菌制剂奠定了坚实的基础。