脉冲电场辅助大豆分离蛋白纳米纤维化：高效制备、结构特性与功能提升机制研究

本综述系统探讨了脉冲电场（PEF）技术作为新型物理改性手段，在显著加速大豆分离蛋白（SPI）纳米纤维（SPIFs）形成过程中的关键作用。通过多尺度光谱学分析与功能特性评估，揭示了PEF通过调控疏水相互作用、促进β-折叠构象有序化及酸水解效应，有效改善SPIFs的乳化活性与结构柔性，为功能性食品配料设计提供了创新性策略。

　　

Highlight

大豆分离蛋白纳米纤维（SPIFs）虽具备独特功能特性，但其纤维化动力学过程缓慢。本研究探索脉冲电场（PEF）作为突破该瓶颈的新策略。具体而言，通过硫黄素T（Th T）荧光与纤维转化率建立纤维生长动力学模型，并联合多光谱技术及SDS-PAGE分析PEF处理前后SPI的结构变化，系统表征SPIFs的理化性质。最后通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和乳化活性指数评估功能性能。

Results

结果显示，当纤维转化率达到约25%时，PEF预处理将水浴时间从8小时（8h组）显著缩短至4小时（P-4组）。对P-4组和8h组的详细比较表明：PEF处理后的纤维表现出更高的β-折叠含量（42.4% vs. 38.5%）、更低的表面疏水性（降低约30%）、更小的纤维直径（85.8 nm vs. 120.6 nm），以及在透射电镜（TEM）下观察到更柔韧弯曲的形态。基于此，提出潜在机制：（1）PEF加速疏水蛋白区域暴露，增强驱动纤维聚集的疏水相互作用；（2）PEF诱导构象变化，促进结构有序化，可能在滞后阶段促进纤维核形成；（3）PEF松散蛋白结构并促进酸水解产生更小亚基或多肽，从而形成构象更灵活、乳化性能提升的纤维。这些发现突显PEF作为调控蛋白质纳米纤维形成的有效物理工具，为功能性食品配料设计开辟新途径。

Introduction

蛋白质纳米纤维最初在医学领域被发现，与阿尔茨海默症和帕金森病的发病机制相关（Jones & Mezzenga, 2012）。后续研究揭示了其在生物学、材料科学和食品科学中的独特优势与应用潜力。尤其在食品科学与实际加工应用中，因其高长径比和丰富的交叉β-折叠结构（Chiti & Dobson, 2006; Hong et al., 2016）而取得显著进展。相较于天然蛋白质，纳米纤维在极端条件下表现出卓越稳定性，并具备增强的功能特性，如黏度、乳化能力等。

现有食品科学中蛋白质纤维研究主要聚焦于：（1）不同来源（动物、植物和微生物）及不同性质蛋白质的纤维化能力，如β-乳球蛋白（Lin et al., 2020）、乳清分离蛋白（Hu et al., 2019）、真菌蛋白（Pham et al., 2018）和大豆分离蛋白（SPI）（Yu et al., 2024）；（2）通过纤维化改性提升功能特性（如乳化和发泡）及机制。例如常规热处理诱导SPI中7S/11S亚基的酸催化水解，形成直径10-20 nm、长度1-5 μm的纳米纤维（Xia et al., 2017; Yu et al., 2024），显著提升乳化活性指数（EAI）和乳液稳定性指数（ESI）（Zhao et al., 2025）。其机制归因于纳米纤维的高长径比（>100:1）提供更大界面面积，而纤维网络通过空间位阻稳定乳液（Meng et al., 2022; Yu et al., 2024）；（3）纤维形成反应的动力学和热力学，包括初始阶段自发成核的反应级数及关键参数——临界核的物理尺寸（Andela Saric et al., 2016）；（4）纤维化改性的潜在机制，包括共价键断裂（如低pH下天冬酰胺/谷氨酰胺残基脱酰胺和二硫键断裂触发亚基解离）和非共价重排（如疏水区域暴露、通过氢键和范德华力实现β-折叠聚集）。

然而，传统热处理制备纳米纤维面临效率低（纤维转化率低）、处理时间长（>10 h）和能耗高（处理温度≥85°C）等挑战，严重限制其实际应用。因此，突破这些限制已成为重要研究焦点。近期该领域进展包括Wang等（2023）利用射频加热处理乳清分离蛋白，以及Afkhami等（2023）采用微波处理SPI，均在纤维化SPI制备中取得积极结果。但除射频与微波外，其他技术能否更好解决该问题仍值得深入探索。

脉冲电场（PEF）技术作为一种新兴物理加工方法，具备极短处理时间（微秒级）、低能耗和高效率等显著优势，近年来在食品工程与生物技术领域备受关注，尤其在蛋白质改性方面（Liu et al., 2017; Wang et al., 2016）。大量研究表明，通过施加高强度瞬时电脉冲，PEF处理可导致化学基团电离并破坏多肽链内或蛋白质单体单元间的静电相互作用，从而通过改变α-螺旋和β-折叠等空间构象（Hong et al., 2016; Liu et al., 2017; Zhao et al., 2014）引发蛋白质结构变化，有效增强乳化、发泡和凝胶等功能特性（Pereira et al., 2024; Taha et al., 2022）。例如，既往研究报道在27 kV/cm的PEF处理下成功制备卵白蛋白纳米管，并改性其二级结构诱导空间展开（Wei et al., 2018）。

PEF能否用于辅助蛋白质纤维化过程，调控蛋白质结构与功能特性，同时凭借其高效可持续的独特优势加速这一缓慢动力学过程，是一个极具吸引力的科学问题。然而该领域研究仍处于空白。此外，若PEF有效促进蛋白质纤维化，几个关键问题值得深入探究：其潜在机制是什么？PEF辅助产生的纤维是否与传统方法制备的具有显著差异？该策略在何种程度上提升功能特性？这些问题亟需系统探索。

SPI是一种广泛可得、营养丰富的植物蛋白（Huang et al., 2019），但其在食品加工中的应用长期受限于较差的界面扩散性和油水吸附能力。现有研究证明SPI的纤维化改性可克服其紧密球状构象、低表面疏水性和高分子量等缺点，显著增强功能特性（Duque-Estrada et al., 2020; Wang et al., 2024; Wu et al., 2020）。然而，应用PEF辅助SPI纤维化改性是否效果更优，或能否相较传统纤维化方法进一步改善功能特性，仍不明确。

因此，本研究选择极具代表性的SPI为研究对象，旨在通过PEF辅助热纤维化改性提升纤维化效率、克服其功能特性缺陷，并探索PEF在优化蛋白质纳米纤维制备中的潜在应用、其对纤维化过程的具体影响及潜在机制。具体而言，通过常规热处理和PEF辅助热处理制备SPIFs，利用Th T荧光、透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）研究纤维化过程与动力学；采用圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和内在荧光光谱等多光谱技术表征SPIFs的二级和三级结构变化；进一步通过测量SPIFs稳定乳液的EAI和ESI全面评估两种方法所得SPIFs的乳化性能，并使用CLSM观察油滴微观结构。本工作为PEF预处理对蛋白质纳米纤维形成的影响及调控机制及其对功能特性的作用提供了基础见解。

Conclusion

本研究中，我们系统应用PEF处理SPI以制备SPIFs，探究了PEF对纤维化动力学、结构特性和功能性能的影响。结果表明，单独PEF处理天然SPI可诱导其构象和三级结构的显著改变：原本紧凑的球状蛋白变得更加松散组织化，同时表面疏水性显著增加，巯基部分氧化以及二硫键重排。更重要的是，PEF预处理通过促进疏水相互作用、增强结构有序性并诱导形成更小且更灵活的纤维核，显著加速了热诱导纤维化过程。最终，PEF辅助制备的SPIFs表现出更优的乳化性能，包括更高的EAI和ESI值，这主要归因于其更小的纤维尺寸、更高的结构柔韧性和增强的界面活性。本研究为蛋白质纳米纤维的高效可持续制备提供了新视角，并彰显PEF技术在功能性食品配料开发中的巨大潜力。