利用乙醇和离子表面活性剂调控牛血清白蛋白的冷诱导凝胶化行为及其机制研究

本研究针对传统热诱导蛋白凝胶化能耗高、易破坏热敏成分的问题，探索了乙醇诱导牛血清白蛋白（BSA）在低温下形成凝胶的新途径。通过小角中子散射（SANS）、动态光散射（DLS）和流变学分析，发现乙醇浓度升高可显著降低凝胶温度（TG）至38°C，并增强凝胶强度（G′提升至250 Pa）。有趣的是，阴离子表面活性剂SDS能通过调控疏水吸引与静电排斥的平衡抑制凝胶形成。该研究为食品和生物材料领域提供了低能耗、可控的蛋白凝胶化策略。

　　

在食品科学和生物材料领域，蛋白质凝胶化是调控产品质构、稳定性和功能性的关键过程。传统的热诱导凝胶化需要高温处理，不仅能耗高，还可能破坏热敏感成分（如益生菌或生物活性分子）。因此，开发在低温甚至室温下实现蛋白质凝胶化的“冷诱导凝胶（cold-set gelation）”技术具有重要意义。牛血清白蛋白（BSA）作为一种模型蛋白，其凝胶行为被广泛研究。以往研究表明，通过调节pH、离子强度或添加盐类可以促进冷诱导凝胶化，但这些方法通常仍需一定加热步骤。近年来，有机溶剂（如乙醇）因其能破坏蛋白质二级结构、促进疏水相互作用而被探索作为诱导冷凝胶的试剂。然而，乙醇诱导的凝胶化过程难以精确控制，且其与表面活性剂等添加剂的相互作用机制尚不明确。

为了系统研究乙醇如何诱导BSA的冷凝胶化，并探索表面活性剂对这一过程的调控作用，研究人员设计了一系列实验。他们通过动态光散射（DLS）监测蛋白质尺寸随温度的变化，通过流变学测量凝胶强度，并利用小角中子散射（SANS）揭示了凝胶纳米结构的演变。特别地，他们考察了阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）对乙醇诱导凝胶化的抑制效应，并从相互作用力的角度解释了其机制。该研究发表于《Food Hydrocolloids》，为低温条件下精确控制蛋白质凝胶化提供了新见解。

研究主要采用了以下技术方法：使用动态光散射（DLS）分析蛋白质流体力学历程和聚集状态；通过流变学频率扫描测定凝胶的储能模量（G′）和损耗模量（G″）以评估凝胶强度；利用小角中子散射（SANS）解析凝胶的分形结构和微观形貌（实验在澳大利亚OPAL反应堆和瑞士PSI的中子源完成）；通过透光率测试和试管倒置实验宏观判断凝胶化温度（T_G）和凝胶形成。

3.1. 透射测量

研究人员通过监测样品透光率随温度的变化来确定凝胶化温度（T_G）。发现纯BSA水溶液的T_G约为80°C，而添加乙醇后T_G显著降低：10 wt.%乙醇时降至60°C，20 wt.%时为55°C，30 wt.%时低至38°C。流变学结果显示，凝胶强度随乙醇含量增加而增强，储能模量（G′）从0 wt.%乙醇时的20 Pa升至30 wt.%时的250 Pa。有趣的是，添加SDS后（如40 mM），即使存在20%乙醇，样品在加热至70°C时仍保持溶液状态，未见凝胶化。这表明SDS能有效抑制乙醇诱导的冷凝胶化。

3.2. 不同酒精含量下BSA的冷凝胶化

3.2.1. 动态光散射（DLS）尺寸演化

DLS数据显示，在纯水中，BSA的流体力学尺寸（D_h）在60°C以下仅轻微增加，超过60°C后显著增大，表明蛋白质展开和聚集。而在乙醇-水混合溶剂中，尺寸增大的起始温度降低，例如在20%乙醇中，50°C即观察到D_h显著上升。圆二色谱结果支持乙醇在室温下即可引起BSAα-螺旋结构的损失，证实其部分去折叠作用。

3.2.2. 凝胶的流变行为

频率扫描表明，所有凝胶样品均表现出典型的固体行为（G′ > G″且基本不依赖频率）。随着乙醇浓度增加，G′显著上升，尤其在30%乙醇时凝胶呈现纯弹性特征，说明乙醇促进了更致密交联网络的形成。

3.2.3. SANS研究结构演化：乙醇的影响

SANS揭示，纯BSA在加热过程中低Q区散射强度上升，可用方阱吸引势模型拟合，表明蛋白质间吸引力增强。在乙醇存在下，凝胶化在更低温度触发，且散射曲线显示分形结构特征。数据分析采用两阶段模型：质量分形网络（Fisher-Burford形式因子）和大尺度不均匀性（幂律行为）。分形维数（D_f）和回转半径（R_g）随乙醇含量和温度增加而增大，表明凝胶网络更紧凑、分支更多。在30%乙醇时，散射曲线在宽Q范围内呈现Q^-3依赖，提示形成致密的表面分形结构，与电镜观察和流变学的高强度一致。

3.2.4. SANS证实室温冷凝胶化

在30%乙醇和30°C条件下，SANS低Q区出现线性散射，直接证实了室温凝胶化。且结构特征在40°C以上即趋于稳定。

3.3. BSA蛋白冷凝胶化的抑制

添加SDS（如40 mM）后，DLS显示BSA的D_h在加热过程中不再显著增加，表明凝胶化被抑制。SANS数据在55°C下与溶液状态相似，且拟合参数显示蛋白质间吸引力深度和范围减小。这种抑制效应源于SDS的两方面作用：一是其胶束与乙醇相互作用，减弱乙醇的蛋白变性效果；二是SDS结合到BSA正电斑块后增加净负电荷，增强静电排斥，从而对抗乙醇促进的疏水吸引。先前研究也表明SDS对热变性有保护作用，与本结果一致。

本研究证实乙醇能有效诱导BSA的冷诱导凝胶化，显著降低凝胶温度并增强凝胶强度。其机制涉及乙醇促进蛋白质去折叠和疏水相互作用。而SDS通过增强静电排斥和减弱疏水吸引抑制该过程。这些发现为在食品加工和生物材料设计中实现低温、可控的蛋白质凝胶化提供了理论依据和技术途径，有望应用于节能加工、热敏成分保护和产品质构精准调控等领域。