通过序贯共发酵工艺对脱脂棉籽粕进行解毒处理和营养改良，并生产低毒性的棉籽肽

《Industrial Crops and Products》：Detoxification and nutritional improvement of defatted cottonseed meal through sequential co-fermentation and the production of a low toxic cottonseed peptides

本研究通过分阶段固态发酵耦合酶解技术，利用Bacillus subtilis natto和Meyerozyma guilliermondii协同作用，显著提升棉籽粕（CSM）的营养价值和安全性。首阶段以WST-M1降解CSM中的棉酚（FG降至653.26 mg/kg），次阶段以N-2增强蛋白质水解（总蛋白达59.47%），酶解后获得低毒小肽产品（FG仅89.73 mg/kg，小肽占比91.93%）。该技术为棉籽粕高值化利用提供了新路径。

　　棉花籽粕作为一种丰富的非常规植物蛋白资源，近年来因其在缓解饲料资源短缺方面的潜力而受到广泛关注。然而，关于其高附加值开发的研究仍相对有限。本研究旨在通过与枯草芽孢杆菌纳豆菌株N-2和酵母菌株WST-M1的共发酵，同时提升棉花籽粕的蛋白营养价值和安全性。研究结果表明，通过这种共发酵方法，可以开发出一种具有高营养价值的蛋白肽产品，从而推动棉花籽粕的高价值利用。在优化实验的基础上，确定了N-2菌株的最佳发酵条件，并通过顺序共发酵实现了N-2和WST-M1的生物功能互补。经过顺序共发酵的棉花籽粕中，水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白分别达到34.13±1.02%和26.10±0.91%，游离棉酚含量降至653.26±16.25 mg/kg。此外，通过酶解提取方法，从顺序共发酵的棉花籽粕中成功提取出低棉酚含量的棉花籽蛋白肽，其总蛋白含量达到59.47%，小肽比例高达91.93%（包括78.24%的小于1000 Da的肽），总棉酚和游离棉酚分别降至130.15 mg/kg和89.73 mg/kg。

棉花籽粕在全球范围内是一种重要的农作物，其年产量逐年增加，每年可产生约4500万吨的棉花籽。经过加工后，可以得到超过1000万吨的富含蛋白质的棉花籽粕（CSM），这种副产品具有作为动物饲料补充剂的潜力。棉花籽粕含有约40-55%的蛋白质，其中超过90%为贮藏蛋白。这些贮藏蛋白含有超过2000种独特的肽，部分肽具有多种生物学功能，如储存、抗氧化活性和能量代谢。值得注意的是，棉花籽粕的氨基酸组成与大豆粕相似，同时不含抗原性蛋白和抗营养性寡糖。这些优势使得棉花籽粕成为一种具有潜力的可持续和高质量的蛋白质来源，能够满足动物饲料日益增长的需求。

然而，棉花籽粕在饲料中的应用受到棉酚的影响，这是一种有毒的多酚，会影响动物的生长和繁殖。为了消除棉酚的不良影响，已广泛采用加热和提取等方法。然而，这些方法存在成本高、效果有限和能耗大的问题。近年来，微生物发酵作为一种高效的生物加工方法被用于棉花籽粕的处理，能够有效去除棉酚或提高营养价值。一些微生物如热带假丝酵母、 Candida tropicalis、曲霉菌和酿酒酵母已被证明具有降解棉酚的能力。这些微生物还能通过提高蛋白质、氨基酸和多种维生素的含量，增强棉花籽粕的营养价值，使其成为更优质的动物饲料。

尽管单菌发酵在某些方面表现良好，但其在同时提升棉花籽粕的营养价值和去除棉酚方面仍存在局限性。本研究中，菌株WST-M1在固态发酵（SSF）过程中能够有效降解总棉酚（TG）和游离棉酚（FG），但其发酵后的样品在营养成分方面没有显著提升。因此，结合WST-M1的脱毒能力与其他策略，可以进一步提升棉花籽粕的营养价值和特性，使其在动物饲料领域更具竞争力。

枯草芽孢杆菌纳豆（Bacillus subtilis natto）是一种来源于日本传统发酵食品纳豆的枯草芽孢杆菌的亚种，以其强大的蛋白酶活性而著称。该菌株能够产生高产量的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和其他水解酶，这些酶可以高效分解蛋白质、碳水化合物和脂肪等大分子，将其转化为氨基酸、有机酸、寡糖等易吸收的成分。其发酵能力已被证明能够提升农业工业副产品的营养价值，包括大豆粕和花生粕。此外，B. subtilis natto还能合成多种生物活性化合物，如纳豆激酶、超氧化物歧化酶、异黄酮、皂苷和维生素，这些化合物具有抗高血压、降血脂、抗氧化和促凝血等生理益处。

结合WST-M1的脱毒能力和B. subtilis natto的营养提升能力，建立一个混合发酵系统可以同时实现棉酚的降解和营养成分的增强。已有研究表明，B. subtilis natto参与混合发酵系统能够显著提高植物蛋白的营养和功能特性。然而，关于其在棉花籽粕混合发酵中的应用仍较为有限。

本研究的主要目标是通过使用N-2和WST-M1菌株建立一个混合发酵系统，以提升棉花籽粕的营养价值。首先，通过优化实验确定了N-2菌株的最佳发酵条件。随后，系统评估了N-2和WST-M1在混合固态发酵中的可行性，包括不同温度和湿度条件下的蛋白溶解和棉酚降解动力学。最后，基于顺序共发酵的棉花籽粕，开发出一种低毒性的蛋白肽产品。这些结果为棉花籽粕的高价值利用提供了理论基础和技术支持。

在实验方法部分，首先进行了棉花籽粕发酵条件的优化。通过调整初始湿度、温度、初始接种量和发酵时间，系统地评估了这些参数对棉花籽粕营养价值提升的影响。结果显示，初始湿度为50%时，发酵后的水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白含量最高，分别达到30.06%和22.16%。过高或过低的湿度都会显著影响N-2菌株的蛋白酶活性，限制其代谢活动和发酵效率。因此，适宜的湿度对于最大化N-2的蛋白酶性能至关重要。

温度也是影响N-2发酵效率的关键因素。实验发现，在38°C时，N-2菌株的蛋白酶活性达到峰值，水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白含量分别达到31.45%和25.12%。然而，温度过高可能会对微生物代谢产生压力，改变其代谢倾向。因此，最佳发酵温度被确定为38°C，这同时也是B. subtilis natto的最佳生长温度。

初始接种量也是影响发酵效果的重要因素。实验表明，初始接种量为12.5%时，水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白含量最高，分别达到32.88%和27.28%。然而，较低的接种量也能达到预期的发酵效果，水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白含量分别达到30.36%和20.18%。考虑到种子溶液的制备难度和成本，初始接种量被设定为5.0%。

发酵时间的延长对SSF过程中的蛋白酶活性有显著影响。水溶性和三氯乙酸可溶性蛋白含量随着发酵时间的增加而显著上升，分别在24小时达到32.33%和25.82%，并在36小时进一步上升至34.53%和27.54%。然而，发酵时间延长至48小时时，蛋白酶活性略有增强，但同时出现了氨味，甚至在30小时后变得刺鼻，严重影响了发酵产品的感官质量。因此，最佳发酵时间为24小时。

在混合固态发酵的可行性分析中，研究评估了N-2和WST-M1菌株在不同温度和湿度条件下的协同作用。实验发现，在45%湿度和30°C的条件下，WST-M1菌株能够有效降解总棉酚和游离棉酚，但N-2菌株的蛋白酶活性受到抑制。提高湿度至50%可以部分恢复N-2的蛋白酶活性，但同时会降低WST-M1的棉酚降解效率。提高温度至38°C显著增强了N-2的蛋白酶活性，但对WST-M1的棉酚降解能力产生负面影响。因此，混合发酵的条件对两种菌株的生理功能存在显著影响，需要优化参数以实现最佳效果。

基于上述结果，研究开发了一种顺序共发酵策略，以克服两种菌株在混合发酵过程中的竞争和代谢干扰。顺序共发酵过程分为两个阶段：第一阶段使用WST-M1菌株在45%湿度和30°C下进行120小时的发酵，以实现棉酚的降解；第二阶段使用N-2菌株在50%湿度和38°C下进行24小时的发酵，以提高蛋白的营养价值。这种方法实现了两种菌株功能的互补，同时避免了代谢干扰。

在酶解提取和条件优化部分，研究评估了不同商业酶（风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶）对棉花籽粕和顺序共发酵后的棉花籽粕（SFCSM）的酶解效率。结果显示，碱性蛋白酶在SFCSM的酶解过程中表现出最高的蛋白和可溶性固体回收率。因此，碱性蛋白酶被选为酶解提取的首选。进一步优化酶解条件，确定了最佳的酶解时间和pH值。在4小时的酶解时间下，总蛋白和可溶性固体回收率分别为64.45%和55.30%。而在pH值为9.0的条件下，总蛋白和可溶性固体回收率分别达到77.53%和58.80%。虽然pH值为10.0时回收率更高，但过高的pH值会导致酶解产物颜色变深并产生氨味，影响其感官质量。因此，最佳的酶解pH值被确定为9.0。

最终的低毒性棉花籽蛋白肽（LGCPP）具有优异的营养价值和安全性。其总蛋白含量达到59.47%，三氯乙酸可溶性蛋白含量为42.60%，总棉酚和游离棉酚含量分别降至130.15 mg/kg和89.73 mg/kg。这些结果表明，酶解提取方法不仅能够有效浓缩SFCSM中的营养蛋白成分，还能进一步降低棉酚含量，从而提高最终产品的安全性。

在氨基酸组成分析中，LGCPP的总氨基酸含量比棉花籽粕提高了26.39%，游离氨基酸含量增加了7.089%。其中，精氨酸和谷氨酸是棉花籽蛋白的主要氨基酸，但精氨酸含量仅略有增加，而谷氨酸含量显著提高，从10.7%增加到16.57%。此外，7种必需氨基酸（EAAs）的含量均有显著提升，包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸。这些氨基酸的提升表明，LGCPP具有更高的消化吸收能力和潜在的健康益处，有助于动物的正常生长和健康。

分子量分布分析显示，LGCPP中的蛋白成分分子量大于5000 Da的比例仅为4.48%，而分子量小于3000 Da的蛋白成分占比高达91.93%，其中分子量小于1000 Da的蛋白成分占比达到78.24%。这种高比例的小肽成分使得LGCPP在消化吸收方面优于原始的棉花籽粕，具有更高的营养价值和应用潜力。

综上所述，本研究成功建立了顺序固态共发酵系统，利用B. subtilis natto和M. guilliermondii，实现了棉花籽粕的蛋白营养价值提升和棉酚的有效降解。同时，通过酶解提取方法，开发出一种低毒性、高营养价值的蛋白肽产品，进一步提升了棉花籽粕作为动物饲料的性能。该研究不仅为棉花籽粕的高价值利用提供了理论基础，还为开发高质量的饲料原料提供了实际的技术支持。