构建一种双酶级联生物反应系统，用于半纤维素衍生的糠醛的可持续生物转化，以生成糠呋喃胺

《Industrial Crops and Products》：Construction of a dual-enzyme cascade bioreaction system for sustainable biotransformation of hemicellulose-derived furfural to furfurylamine

构建了HN-AlaDH双酶共表达系统，优化反应条件（40℃、pH7.5）和分批补料策略，实现200 mM FAL至92.6% FLA的高效转化。结合ChCl/MA/MaA深熔盐溶剂，通过化学催化D-xylose脱水生成FAL，再经生物催化转化为FLA，整体转化效率达94.5%。该策略简化流程并提升效率，为绿色化学品生产提供新路径。

　　近年来，随着全球对可持续发展和绿色制造的重视，生物催化技术在生物基化学品的合成中展现出巨大的潜力。尤其是针对呋喃类化合物的合成，生物催化技术以其温和的反应条件、高选择性以及对环境的友好性，逐渐成为替代传统化学合成的重要手段。在这一背景下，研究者们致力于开发更高效、更环保的生物催化路径，以实现从生物质到高附加值产物的绿色转化。本研究正是在这一趋势下展开的，其核心目标是构建一种高效的双酶协同催化系统，用于将生物质来源的呋喃化合物转化为更具应用价值的产物——呋喃胺（Furfurylamine, FLA）。

呋喃胺作为呋喃类化合物的重要衍生物，广泛应用于化工、医药、农业、食品等多个领域。它可以用于生产燃料增效剂、功能性纤维、医药中间体以及聚合材料等。然而，传统化学合成方法通常需要高温高压条件，并且依赖昂贵的金属催化剂和无机酸，不仅增加了生产成本，还带来了环境污染和设备腐蚀等问题。相比之下，生物催化方法通过利用特定酶的高效催化能力，在常温常压和中性pH条件下实现高效的胺化反应，显著降低了对环境的影响，同时提高了反应的选择性和效率。

本研究创新性地构建了一种双酶共表达的重组大肠杆菌HN-AlaDH系统，其中HN为一种由烟曲霉（*Aspergillus terreus*）改造的ω-转氨酶（His→Asn在第210位），而AlaDH则来源于枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis* 168）。通过优化双酶表达系统，研究团队引入了一种新型的胺供体——D-丙氨酸-NH?Cl混合供体，从而有效抑制了丙酮酸的积累，同时显著提高了催化效率。在优化的反应条件下（40°C，pH 7.5），实现了200 mM呋喃醛（FAL）在16小时内高效转化为FLA，最终产率高达92.6%。这一成果不仅体现了生物催化在可持续化学合成中的巨大潜力，也为相关产业的绿色转型提供了重要的技术支撑。

为了进一步提高整体反应效率，研究团队还开发了一种集成的化学-生物级联催化工艺。首先，利用三元深共熔溶剂（DES）ChCl/MA/MaA（15 wt%）对生物质来源的D-木糖进行脱水反应，生成FAL。随后，在同一反应体系中，通过HN-AlaDH细胞的生物催化作用，将D-木糖衍生的FAL进一步转化为目标产物FLA。整个过程的总转化效率达到了94.5%（基于FAL的负载量），表明该方法在工艺流程简化和反应效率提升方面具有显著优势。

在生物胺化反应中，反应条件对催化效率有着重要影响。通过系统研究不同胺供体类型和用量、反应温度以及反应体系pH值，研究团队发现D-丙氨酸是最适合的胺供体。当D-丙氨酸与FAL的摩尔比为6:1时，催化效率达到最佳。此外，通过引入NH?Cl作为辅助供体，不仅降低了D-丙氨酸的用量，还有效促进了丙酮酸向L-丙氨酸的转化，从而避免了产物对反应体系的反馈抑制。实验结果表明，使用D-丙氨酸-NH?Cl混合供体的反应系统，相较于传统方法，能够显著提升反应效率，并降低原料消耗。

对于反应温度和pH值的优化也表明，40°C和pH 7.5是实现最佳转化效率的条件。当温度升高至45°C时，催化活性明显下降，这可能是由于高温导致酶蛋白变性或失活。同样，pH值偏离7.5时，酶的构象也会发生变化，从而影响催化性能。因此，选择适宜的反应条件对于提升生物催化效率至关重要。

为了应对高浓度底物可能带来的抑制效应，研究团队还采用了一种批次补料策略。通过在反应过程中分阶段加入FAL，可以维持反应体系中的底物浓度在非抑制范围内，从而保证酶的高效催化活性。实验结果显示，在使用批次补料策略的情况下，FLA的产率达到了92.6%，并有效避免了高浓度底物对反应过程的不利影响。这种方法不仅提高了反应效率，还简化了工艺流程，为工业级生产提供了可行的技术路径。

在化学催化阶段，研究团队考察了不同类型的DES对D-木糖转化为FAL的影响。结果显示，ChCl/MA/MaA（15 wt%）作为一种三元DES，能够显著提高FAL的产率，达到68.9%。相较于其他单组分或双组分DES，这种三元DES由于其更稳定的氢键网络，能够有效促进底物的传质过程，提高反应效率。此外，研究还发现，在DES水体系中，FAL的生成与反应时间密切相关。当反应温度为180°C，反应时间为30分钟时，FAL的产率最高。然而，延长反应时间至60分钟会导致FAL的降解，从而降低产率。因此，确定合适的反应条件对于最大化FAL的产率至关重要。

本研究的创新之处在于，将化学催化与生物催化相结合，构建了一种高效的化学-生物级联催化体系。该体系不仅避免了传统方法中对有机溶剂的依赖，还显著降低了对昂贵催化剂的需求。通过采用D-丙氨酸-NH?Cl混合供体和批次补料策略，研究团队成功地将FAL的转化效率提升至92.6%，同时将D-丙氨酸的用量减少了62.5%，相比传统系统更为经济高效。此外，该方法在温和条件下（40°C，常压）进行反应，具有良好的环境兼容性，符合绿色化学的发展理念。

研究结果表明，这种集成的化学-生物催化策略为生物质转化为高附加值呋喃化合物提供了一种新的绿色路径。在工业应用层面，该方法具有良好的可扩展性和稳定性，能够有效应对高浓度底物的抑制效应，提高生产效率。通过这一技术，不仅可以减少对化石资源的依赖，还能降低生产过程中的环境负担，推动相关产业向更加可持续和环保的方向发展。

未来，随着对生物催化技术的深入研究，开发更多高效、稳定、多功能的催化剂将成为提升生物质转化效率的关键。此外，针对不同来源的生物质废弃物（如农业秸秆、林业加工残渣等），探索更有效的预处理工艺和水解条件，将有助于提高D-木糖的提取效率。结合新型绿色溶剂的应用，进一步优化反应体系，有望实现更高转化率和更低能耗。通过这些努力，生物催化技术将在未来发挥更大的作用，为实现“从生物质废弃物到高价值化学品”的转化目标提供更加坚实的技术基础。

总之，本研究通过构建双酶协同催化系统，优化反应条件，并引入化学-生物级联催化策略，成功实现了从生物质到高附加值呋喃化合物的绿色转化。这一方法不仅提高了反应效率，还降低了生产成本和环境影响，为可持续化学合成提供了新的思路。研究结果表明，生物催化技术在合成精细化学品方面具有显著优势，其应用前景广阔，特别是在化工、医药等领域。该研究为相关产业的绿色转型和升级提供了重要的技术支持，充分体现了绿色化学和可持续制造的理念。