新型环保生物杀菌剂：文化遗产保护的生物技术可持续解决方案

为解决文化遗产微生物降解问题，研究人员开展杀手酵母(killer yeasts)产生抗菌毒素的研究，发现S. cerevisiae和K. lactis等菌株提取物对遗产分离菌株具有选择性抗菌活性，蛋白组分(>30 kDa)显示显著抑菌效果且对Artemia franciscana无明显毒性，为文化遗产保护提供了低毒高效的生物技术解决方案。

　　

在世界各地的博物馆、古迹和文化遗产保存场所，微生物正悄然发动一场无声的战争。细菌和真菌在这些珍贵的文化遗产表面定居繁衍，分泌的酶和形成的生物膜不断侵蚀着文物材料的物理结构和美学价值，导致颜料降解、石材崩解甚至不可逆的损伤。长期以来，人们使用化学杀菌剂来对抗这些微生物，但这些传统方法存在明显局限：高毒性、材料兼容性差，还会引发微生物耐药性问题，更不用说对环境保护和人类健康带来的潜在风险。

正是在这样的背景下，来自葡萄牙埃武拉大学的研究团队开展了一项创新研究，探索利用杀手酵母产生的天然毒素作为文化遗产保护的绿色解决方案。这项发表在《International Biodeterioration 》的研究，为文化遗产保护领域带来了新的希望。

研究人员采用了多项关键技术方法开展本研究。从葡萄牙阿连特茹葡萄酒产区的葡萄醪中分离获得酵母菌株，通过分子生物学技术(ITS和LSU rDNA D1-D2区测序)进行菌种鉴定。使用离心过滤和冻干技术制备细胞培养物上清液提取物，通过超滤离心过滤设备获得不同分子量蛋白组分(>50 kDa、50-30 kDa、30-10 kDa、10-3 kDa和<3 kDa)。抗菌活性评估采用纸片扩散法和液体培养生长抑制试验，杀手表型分析使用含亚甲蓝的YMA-MB培养基。毒性评价采用Artemia franciscana致死性生物测定法，以商品杀菌剂作为对照。

3.1. 酵母菌株的鉴定

研究人员对13株从葡萄醪中分离的酵母菌株进行了分子鉴定，这些菌株主要属于Saccharomyces、Kluyveromyces和Torulaspora属，其中S. cerevisiae最为常见。通过ITS和LSU rDNA D1/D2区域测序，研究人员准确鉴定了这些菌株的分类地位，序列已保存在GenBank数据库中。这些菌株选择基于其作为杀手毒素天然生产者的潜力，特别是在对抗文化遗产相关微生物方面的应用前景。

3.2. 抗菌活性筛选

抗菌活性评估显示，酵母菌株的抗微生物效果存在显著差异，取决于酵母种类和提取物形式。

3.2.1. 抗菌和抗真菌纸片扩散

研究表明，细胞培养物上清液(FB和LB)在纸片扩散试验中显示出细胞外生物活性化合物的存在。S. cerevisiae 1、5、7、8和12菌株对细菌靶标表现出广谱活性。特别是S. cerevisiae 7和12对Gordonia sp.表现出强烈抑制效果，而S. cerevisiae 1显示出最广的抗菌谱，对所有测试的细菌菌株都有抑制活性。有趣的是，冻干提取物通常比过滤液产生更大的抑制圈，表明冻干过程具有浓缩和稳定效应。

杀手表型试验展示了活酵母细胞与微生物靶标的直接相互作用。在亚甲蓝培养基中某些酵母菌落周围出现的透明圈表明具有抗菌和抗真菌特性的杀手毒素的主动分泌。针对细菌活性，仅对两种测试的生物降解细菌菌株(Bacillus sp.和Pseudomonas sp.)检测到抑制。关于抗真菌活性，三种酵母(T. delbrueckii 2、S. cerevisiae 7和K. lactis 9)对Trichoderma sp.、Aspergillus sp.和Penicillium sp.特别有效。

3.2.2. 液体培养中的抗菌敏感性

在液体培养试验中，酵母来源的上清液可以抑制生物降解细菌增殖超过70小时。S. cerevisiae 1完全抑制了所有五种测试的细菌菌株的生长，表明其具有强大而广谱的抗菌效果。抑制曲线证实抗菌效果不仅是立即的，而且是持续的，表明这些生物活性化合物在溶液中随时间保持稳定性。

为了验证液体试验中观察到的抑制效果，将每个孔的悬浮液铺在NB培养基的平皿中，评估是否再生长。结果显示，与阳性对照相比，暴露于S. cerevisiae 1、5、K. lactis 9和K. marxianus 13提取物的平皿中没有观察到细菌菌落，证实抑制是杀菌性的而不是抑菌性的。

3.2.3. 浓缩蛋白提取物的抗菌活性

对最有前途的酵母提取物(S. cerevisiae 1、S. cerevisiae 5、K. lactis 9和K. marxianus 13)进行分级分离，获得5种不同分子量的蛋白组分。这些组分在液体和固体培养基中针对研究的生物降解细菌进行了评估。

液体培养基中的测试结果用于计算每种细菌与不同组分接触后的生长抑制百分比。在固体培养基中，通过测量 discs 周围的抑制圈来评估抗菌活性。结果显示，来自三种酵母物种(S. cerevisiae、K. lactis和K. marxianus)的蛋白组分显示出菌株和分子量范围的显著差异。

两种S. cerevisiae菌株表现出高且一致的抗菌活性，特别是在>50 kDa、50-30 kDa和30-10 kDa组分中，对几乎所有测试的细菌都观察到接近100%的抑制。10-3 kDa组分保持良好的活性，但<3 kDa组分没有显示抑制活性，观察到细菌生长，表明该低分子量范围内缺乏抗菌化合物。

K. lactis 9菌株表现出强大的抗菌活性，特别是在>50 kDa、50-30 kDa和30-10 kDa组分中，与S. cerevisiae相似。然而，K. marxianus 13菌株表现不太一致，在大多数组分中几乎没有抑制，甚至在特定条件下刺激细菌生长。

关于琼脂扩散试验中观察到的抑制圈，通常较为适中，从接近0的值到约9 mm，更大的活性与更高分子量的蛋白组分(>50 kDa和50-30 kDa)相关。K. lactis 9菌株在琼脂试验中表现突出，显示出最大的抑制圈，特别是对M. luteus、Gordonia sp.和Bacillus sp.的>50 kDa组分。

3.3. 酵母无细胞培养物浓缩组分的毒性评估

使用Artemia franciscana致死性测定进行的细胞毒性评估显示，无细胞和冻干酵母培养物上清液具有不同的毒性特征。根据该方法的原则，低于10%的死亡率不被认为具有毒性作用，因此作为区分非毒性和潜在有害样品的阈值。

无细胞培养物上清液显示出低毒性，只有四个样品超过10%的阈值，表明在其天然状态下细胞毒性潜力有限。相比之下，冻干无细胞上清液在10 mg/mL的显著更高浓度下测试，比100 μg/mL的重铬酸钾阳性对照高100倍，在几种情况下表现出更高的死亡率水平。

此外，当来自四个选定菌株的无细胞培养物上清液按分子量(>50 kDa、50-30 kDa、30-10 kDa、10-3 kDa、<3 kDa)分级时，所有 resulting 组分都表现出远低于10%的死亡率值，进一步支持这些提取物中单个组分的非毒性性质。

为了进一步将酵母来源提取物的细胞毒性结果背景化，研究人员使用文化遗产保护中常用的商业合成杀菌剂进行了比较评估。Preventol? Ri 50、Biotin-T?和New Des?在相同的Artemia franciscana致死性测定条件下测试，LC₅₀值分别为0.00031%、0.00062%和0.00026%。

这些物质在这种体内模型中显示出高水平的急性毒性，致死浓度异常低于用于酵母来源提取物的浓度，后者在10 mg/mL的固定浓度下测试，对应1%，大约是商业杀菌剂LC₅₀值的1600-3800倍。重要的是，一些冻干酵母提取物，特别是来自K. lactis 9和K. marxianus 13的，在这个提高的浓度下仍然没有超过10%死亡率阈值，加强了它们的低细胞毒性潜力。

研究结论表明，选择性酵母菌株(主要来自Saccharomyces、Kluyveromyces和Torulaspora属)作为文化遗产保护的环保抗菌剂具有潜力。这些酵母通过细胞外代谢物生产或杀手表型表达显示出菌株特异性的抗菌和抗真菌活性。蛋白分级表明高分子量化合物(>30 kDa)，可能是杀手毒素，负责生物活性。毒性评估显示，即使在10 mg/mL的高浓度下，大多数酵母提取物和组分在Artemia franciscana试验中也表现出可忽略的毒性，而商业杀菌剂在浓度低160-380倍时导致100%致死率。

这些发现强调了杀手酵母在遗产保护领域的创新应用，提供了有效、低毒的传统杀菌剂替代方案。研究结果支持使用酵母来源代谢物作为化学杀菌剂的可持续、绿色和低毒性替代品，用于微生物控制和预防性保护策略。未来的工作将包括确定最活跃组分的最低抑制浓度(MICs)，使用LC-MS鉴定其分子组成，并研究其抗菌作用模式，以更好地了解其杀菌特性并支持其在保护环境中的安全有效应用。