综述：农场动物冠状病毒：疫苗是解决方案

本综述系统探讨了农场动物冠状病毒（CoV）的流行现状、基因多样性及人畜共患潜力，重点分析了现有疫苗的局限性，并综述了新一代疫苗（包括亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）、mRNA疫苗及病毒载体疫苗等）的最新研发进展。文章强调，针对牛冠状病毒（BCoV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等病原，开发能诱导广泛交叉保护性免疫（针对多种基因型）的安全有效疫苗，是控制动物疫情、保障畜牧业经济及防范公共卫生风险的关键策略。

　　

农场动物冠状病毒：疫苗是解决方案

摘要

含有RNA的冠状病毒在自然界中广泛存在，可感染多种脊椎动物。动物是人类冠状病毒疾病的潜在来源，动物冠状病毒的种间感染已多次被记录，此类传播可能导致了COVID-19大流行。由于人类与农场动物之间存在持续密切接触，研究和控制农场动物冠状病毒感染的传播至关重要。疫苗接种仍然是预防动物疾病和限制冠状病毒在家禽和牲畜中进一步传播和传播的关键。本综述探讨了对畜牧业构成严峻挑战的农场动物冠状病毒感染、其人畜共患潜力和流行病学特征，并讨论了当前疫苗及其局限性，以及旨在预防家禽和牲畜冠状病毒感染的兽医疫苗的最新进展和趋势。

1. 引言

冠状病毒科（Coronaviridae）（套式病毒目（Nidovirales））包含RNA病毒，这些病毒在自然界中分布广泛，能够感染多种脊椎动物。感染哺乳动物和鸟类的冠状病毒属于正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae），该亚科有四个属：α冠状病毒属（Alphacoronavirus）、β冠状病毒属（Betacoronavirus）、γ冠状病毒属（Gammacoronavirus）和δ冠状病毒属（Deltacoronavirus）。在过去的二十年里，该亚科中已有大量新的病毒种类和毒株被鉴定出来。此外，人类人群中出现了三种新的致命人畜共患冠状病毒感染：SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。哺乳动物CoV主要属于α和β冠状病毒属。特别是，α冠状病毒属包括季节性人类CoV（HCoV-229E和HCoV-NL63），以及猪CoV，如传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）。β冠状病毒属包含五种感染人类的病毒：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2，以及牛冠状病毒（BCoV）。相反，γ和δ冠状病毒主要感染鸟类，但也有例外，如猪δ冠状病毒（PDCoV）和属于γ冠状病毒属的海洋哺乳动物CoV。

自20世纪30年代发现第一个冠状病毒（鸡传染性支气管炎病毒（IBV））以来，正冠状病毒亚科的成员已在多种农场动物中被鉴定出来，包括猪和牛。这些病毒可引起大规模的疾病爆发，并对畜牧业和家禽业构成重大的经济挑战。在2002-2003年SARS-CoV出现之前，冠状病毒研究主要集中于兽医方面，包括兽医疫苗的开发和应用。然而，SARS-CoV爆发后，人们对这一病毒家族的兴趣激增，因为很明显，冠状病毒感染可能对人类构成严重威胁，甚至导致死亡。CoV毒株的遗传多样性、其高突变和重组率以及人与动物的相互作用为向人类的跨物种传播创造了潜在机会。在过去十年中，已鉴定出两种新的猪CoV物种：猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）和PDCoV，后者已被证实具有人畜共患潜力。

疫苗接种在预防动物疾病和遏制CoV在人类和动物中的进一步传播方面起着至关重要的作用。然而，几十年来用于保护农场动物免受CoV侵害的商业许可疫苗已被证明具有与SARS-CoV-2疫苗所遇到的挑战相似的挑战。这些疫苗显著减轻了临床症状和生物样本中的病毒载量，但仍未能完全防止病毒在动物群体中的传播。控制CoV的传播需要更新的疫苗配方和新一轮的免疫接种。尽管如此，从SARS-CoV-2疫苗的开发和许可中获得的丰富经验刺激了针对农业部门具有经济重要性的冠状病毒的新一代疫苗的创建。

2. 冠状病毒的结构特征：结构蛋白的功能和抗原特性

冠状病毒是具有球形或多形性的有包膜病毒，直径80-125 nm。CoV的一个显著特征是病毒粒子表面的 spike 状突起，类似于皇冠的尖刺。基因组（+）RNA（27-32 kb）被包装成螺旋对称的核衣壳。冠状病毒病毒粒子包含四种主要结构蛋白：形成三聚体的 spike（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。一些β冠状病毒的病毒粒子，特别是BCoV和PHEV，还携带一种额外的表面糖蛋白，血凝素酯酶（HE），它在病毒粒子表面形成短刺。E蛋白是一种小的疏水膜蛋白，在病毒组装和释放中起关键作用。M蛋白对于病毒粒子的形成也至关重要。磷酸化的N蛋白是一种RNA结合蛋白，它与病毒RNA形成核衣壳。HE蛋白增强S蛋白介导的细胞进入。S蛋白是病毒附着于宿主细胞受体和随后细胞进入的关键。

受体识别和吸附到细胞表面是病毒感染的第一步，决定了宿主范围和组织嗜性。S蛋白由两个功能亚基组成：S1亚基介导受体结合并包含受体结合域（RBD），而S2亚基驱动病毒膜和宿主细胞膜之间的膜融合。尽管结构相似，冠状病毒S蛋白利用多种宿主细胞受体和辅助受体进行细胞进入，并且可能使用替代受体来适应新宿主和进行种间传播。例如，TGEV、PRCV、PDCoV以及可能的PEDV等病毒使用氨肽酶N作为受体。BCoV、IBV、PHEV和TGEV识别不同的唾液酸衍生物。最近鉴定的SADS-CoV的特异性受体尚未确定。

S蛋白与宿主受体的相互作用是克服物种屏障的关键因素。S蛋白是引发病毒中和抗体的主要抗原。因此，它既是农场动物也是人类疫苗开发的主要成分。

3. 农场动物的冠状病毒感染

3.1. 牛冠状病毒

牛冠状病毒在全球范围内广泛传播，主要引起牛的肠道和呼吸道疾病，给畜牧业造成重大经济损失。BCoV于1972年在美国首次在腹泻犊牛中发现，随后出现在亚洲、欧洲、大洋洲岛屿和非洲。2010年后，BCoV在五大洲的许多国家呈现出日益流行的趋势。病毒可以从体内长时间排出——长达932天。这在感染BCoV Kumamoto/1/07毒株的犊牛中得到证实，表明存在持续感染。BCoV感染的临床表现导致饲养场牛的生长速度降低、成年牛产奶量长期下降以及犊牛的高发病率和死亡率。

根据临床症状，BCoV可分为两组：（1）肠道BCoV，引起犊牛新生犊腹泻和成年牛冬季痢疾；（2）呼吸道BCoV，已从所有年龄的有呼吸道症状的动物中分离出来。对各种BCoV分离株地理分布的研究使其最初被分为两组：欧洲（GI）和亚洲-美洲（GII）。进一步的流行病学研究和毒株的基因组分析揭示了它们的遗传多样性，确定了两个亚组：GIa亚组，包括来自欧洲、亚洲和美国的一些毒株，以及原始的Mebus毒株；GIb亚组，仅包括欧洲毒株。韩国CoV毒株被独立地分配到GIIa亚组，而来自美国、中国、越南和日本的一些BCoV毒株形成了GIIb亚组。关于BCoV在非洲地区的传播和遗传多样性的信息目前有限。然而，在纳米比亚的牛和野生反刍动物种群中进行的一项研究表明，该病毒的流行率相对较高，并揭示了一个独特的纳米比亚进化枝的存在，这具有重要的研究意义。

所有BCoV分离株都属于同一血清型。S蛋白的系统发育分析导致了一个由十四个BCoV基因型组成的分类。尽管它们的临床表现和组织嗜性不同，但毒株的比较基因组和系统发育分析无法根据特定的遗传标记将它们区分为肠道或呼吸道BCoV。

目前，普遍认为疾病的临床表现不是感染特定BCoV毒株的结果，而是由许多其他因素引起的，例如应激、温度、与肠道和呼吸道病原体的共感染的存在，以及动物的年龄和健康状况。

BCoV通过粪-口和气溶胶途径传播，并可能通过受污染的表面传播，病毒在这些表面上保持传染性24小时。临床和亚临床感染的动物都可以作为BCoV的储存库，群内可能发生重复感染，并且病毒可能传播到另一个地理上遥远的群体，而无需直接接触。

有各种证据表明BCoV能够进行种间传播，并在多种动物中引起疾病。已知BCoV影响多种哺乳动物，这些动物最容易受到这种感染；受影响的有二十多种，主要是家养和野生反刍动物。在这些动物的粪便和呼吸道粘膜中检测到了BCoV样毒株。多项研究证实了BCoV频繁的重组事件，这可能负责改变组织嗜性和宿主特异性。尽管牛通常被认为是BCoV的主要宿主，但已在骆驼和狗中发现了这种病毒，它们可能充当人类传播的中间宿主。最近在中国啮齿动物，特别是捕获于牛场附近的达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）中检测到了BCoV。与其它BCoV相比，在达乌尔黄鼠中发现的病毒的全长基因组核苷酸同一性为97.2%–99.4%。

在一名急性腹泻儿童中确定了人类感染的可能性，从中分离出冠状病毒毒株HECV-4408。HECV-4408在遗传和抗原上更接近BCoV而不是人冠状病毒HCoV-OC43。强毒野生型BCoV和HECV-4408之间的S和HE基因的核苷酸序列以及相应蛋白质的氨基酸序列的同源性超过99%。HECV-4408能够感染血清阴性犊牛并引起腹泻，动物感染后对另一种强毒株BCoV-DB2的感染产生100%的保护。基于比较基因组和系统发育分析，假设人冠状病毒HCoV-OC43起源于跨越种间屏障的祖先BCoV毒株。据推测，这种病毒可能是1889-1890年归因于流感病毒（“俄罗斯流感”）的大流行的原因。没有数据可以鉴定生物样本中的病原体。然而，HBV和OC43的受体同一性（N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸）、它们的血清学相似性和96%的核苷酸同一性，作为支持冠状病毒可能跨物种传播给人类的额外间接证据。关于大流行期间感染患者疾病临床表现的医学报告指出与COVID-19有许多共同特征。特别是，他们确定了比流感爆发期间通常看到的更严重的中枢神经系统障碍。许多研究显示了HCoV-OC43的神经嗜性。最近，在一头有神经系统障碍的犊牛的脑组织中检测到了BCoV。这表明人畜共患传播和BCoV传播给人类的风险足够高，足以构成公共卫生威胁。

3.2. 传染性支气管炎病毒

传染性支气管炎病毒（IBV）是称为禽传染性支气管炎的危险病原体。该病最常见于鸡。IBV于20世纪30年代在美国的鸡中发现。从那时起，该病已传播到世界上有工业化家禽养殖场的地方。病毒通过气溶胶途径或直接接触受污染的表面传播。在呼吸道初次感染后，病毒可以全身性传播并感染肾脏以及生殖和神经系统，引起多种疾病症状。感染的严重程度取决于病毒的具体毒株和宿主的免疫状态。严重病例可导致高死亡率（100%）、生产力下降和产蛋损失。这些问题给家禽业造成重大经济损失。

IBV毒株分为血清型（基于交叉病毒中和试验）和基因型。自2016年以来，基于S1亚基序列分析的分类系统已被用于确定基因型。迄今为止，已知有九个基因型（GI至GIX）和41个遗传系。在大多数地理区域，存在几种IBV基因型的共循环，其中一种或两种在种群中占主导地位，但可能周期性地被其他基因型或遗传系取代。最近由Strydom和Abolnik发表的研究在南非鉴定出两种以前未在该地区检测到的IBV基因型。第一种是巴西毒株GI-11，以前未在南美以外检测到。第二种基因型GVI-1，已知仅限于亚洲，但在南非的检测扩大了该病毒的地理范围。进口的受感染家禽被认为是GI-11和GVI-1毒株在南非出现的可能来源。

在俄罗斯联邦，循环着各种GI基因型系的病毒，这些系与欧洲和中国毒株分组，以及不属于任何已知遗传系的IBV变种。基因型/系与血清型之间没有直接相关性。由于高频率的突变和重组，新的病毒变种继续出现。重组可以发生在IBV的不同基因型和系的野毒株和疫苗株之间。重组IBV变种已在世界多个国家报道。

2016年，在中国发现了一种新的重组ahysx-1分离株，引起鸡的肠道疾病。进一步的研究表明，该分离株与中国不同省份收集的其他重组IBV分离株具有高度同源性（氨基酸序列98.0-99.8%）。将13种新的重组IBV与68种不同基因型的IBV序列以及火鸡和珍珠鸡冠状病毒进行了比较。重组分析的结果确定，新分离株的主要基因组供体是IBV基因型GI-19或GVI-1，而掺入的S蛋白序列的供体是火鸡和珍珠鸡冠状病毒。这种具有大流行潜力的新重组病毒的传播可能使疾病预防和控制复杂化。

IBV样冠状病毒已从多种家禽物种中分离出来，如火鸡、野鸡和珍珠鸡，具有不同的症状和疾病严重程度。这些冠状病毒在商业家禽生产发达的地区具有经济重要性。IBV样病毒也从临床健康的野生鸟类代表中分离出来，如鹌鹑、鹧鸪和孔雀，以及其他目的代表，包括野鸭、灰雁、天鹅、水鸭和蓝鸽。这些研究表明了IBV在家养和野生鸟类中的广泛宿主范围、种间传播的高可能性以及通过候鸟远距离传播的可能性。还应注意，在家禽农场工人的血清中检测到了针对IBV的特异性抗体，特别是那些进行鸡气溶胶免疫过程的人。

3.3. 猪冠状病毒发病率

目前有六种冠状病毒在猪中传播，其中四种引起急性胃肠炎，具有相似的临床表现。这些包括：猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒和猪δ冠状病毒。由猪肠道冠状病毒（TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV）引起的疾病不能基于临床症状区分。这些病毒可导致高死亡率，尤其是在血清阴性母猪所产的新生仔猪中。猪呼吸道冠状病毒（PRCV）引起呼吸道疾病，而猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）引起神经、肠道和/或呼吸道疾病。这些病毒通过粪-口和/或空气传播途径传播，以及通过直接接触受污染的表面传播。TGEV、PRCV、PHEV和PEDV已在猪群中传播了几十年。PDCoV和SADS-CoV被认为是新出现的CoV，最初在中国猪群中检测到。TGEV、PRCV、PEDV和SADS-CoV属于α冠状病毒属，而PHEV和PDCoV分别属于β冠状病毒属和δ冠状病毒属。

3.3.1. 传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒

TGEV是第一个在猪中鉴定的冠状病毒，于1940年代在美国爆发期间发现。该病毒迅速传播到全世界，影响亚洲、欧洲、非洲和南美洲的许多国家。直到1980年代，TGEV感染对许多国家的养猪生产构成严重威胁，是仔猪肠道疾病和高死亡率的常见原因，尽管使用了疫苗。然而，随后，腹泻猪的死亡率和TGEV检出率显著下降。TGEV发病率下降的原因之一是其缺失突变体PRCV的出现，该突变体毒力减弱且对呼吸道有嗜性。这种在编码S蛋白的基因中缺失（621-681核苷酸）的TGEV变体于1984年在比利时首次报道。PRCV诱导的感染在大多数情况下是亚临床的或轻微的呼吸道症状。PRCV在全球猪群中的长期流通导致TGEV发病率下降，但TGEV和PRCV抗体的交叉反应性显著复杂化了与TGEV相关的诊断和流行病学情况评估。然而，在中国已经鉴定并表征了由Purdue和Miller毒株重组产生的新强毒TGEV毒株。在欧洲发现了一种新的猪肠道冠状病毒（SeCoV）。SeCoV是TGEV和PEDV重组的结果。SeCoV S蛋白基因与PEDV具有超过90%的同源性，而基因组的其余部分与强毒TGEV毒株具有高达97%的同一性。

狐狸、狗、貂和猫等野生和家养动物被认为是TGEV的潜在亚临床携带者，在季节性流行病之间充当病毒储存库。然而，只有从感染TEGV的狗中分离出的病毒被证实对猪有传染性。

Vlasova等人2022年进行的一项研究报道，在马来西亚因肺炎住院的患者中分离出一种新的CoV变体，犬冠状病毒HuPn-2018（CCoV-HuPn-2018）。大多数患者是生活在农村地区的儿童，经常接触家养和野生动物。比较全基因组分析揭示了CCoV-HuPn-2018与几种犬冠状病毒毒株（90.63%–93.31%）以及TGEV强毒Purdue毒株（91.47%）核苷酸序列的高度同一性。基于全基因组分析的系统发育树包含一个得到很好支持的单系病毒簇，包括CCoV-HuPn-2018、其他犬和猫冠状病毒以及猪冠状病毒TGEV和SeCoV，证明了这些病毒之间的密切遗传关系。研究中呈现的结果不仅报告了在人类中鉴定出一种新的重组CoV，该病毒源于不同α冠状病毒1（Alphacoronavirus 1）毒株之间的多次重组事件，具有近期人畜共患起源，而且也是未来可能公共卫生挑战的令人担忧的先兆。

3.3.2. 猪急性腹泻综合征冠状病毒

猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）最初于2017年在中国广东省的几个养猪场检测到。该病毒导致了一次大规模疫情，导致约25,000头动物死亡。临床表现与猪其他肠道CoV引起的相似，包括严重腹泻和急性呕吐，导致新生仔猪因快速体重减轻而死亡。5日龄以下仔猪的死亡率达到90%。随后的2018年、2021年和2023年，中国农场报告了与SADS-CoV相关的再次疫情。对不同年份获得的分离株的比较基因组分析显示，与2017年获得的首个SADS-CoV分离株具有～99.9%的同一性。系统发育分析表明，所有SADS-CoV毒株都有一个共同来源：生活在广东省的中华菊头蝠（Rhinolophus affinis）。该病毒在首次爆发后的七年里一直在中国的几个省份的养猪场传播。为了调查SADS-CoV从动物向人类传播的可能性，检测了与感染猪有密切接触的农场工人的血清样本中的病毒抗体。在任何样本中均未检测到SADS-CoV特异性抗体。然而，Edwards等人的研究揭示了SADS-CoV传播给人类的人畜共患潜力。尽管SADS-CoV不使用人类冠状病毒ACE-2、DPP4或CD13受体进行对接和进入，但研究表明SADS-CoV在人类原代呼吸道和肠道细胞中有效复制，表明人类对感染的易感性和动物向人类传播的潜力。

3.3.3. 猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）

称为猪血凝性脑脊髓炎的疾病于1957年在加拿大首次报道，仔猪出现呕吐综合征，随后出现神经损伤。然而，直到1962年，在一次新生仔猪脑脊髓炎爆发期间才分离并鉴定了引起该疾病的病毒。PHEV是已知的唯一感染猪的嗜神经冠状病毒。后来，在许多国家检测到了PHEV，包括比利时、捷克共和国、美国、阿根廷、韩国和中国。在四周龄以上的仔猪和成年猪中，感染通常是亚临床的。对于新生仔猪，死亡率可达100%，取决于母猪初乳中特异性抗体的存在。然而，与其他致病性冠状病毒相比，PHEV对猪群的影响相对较小。

很长一段时间内，科学文献中关于该病毒流行病学和毒株遗传多样性的信息很少。最近在美国、韩国和中国进行的流行病学研究提供了强有力的证据，表明PHEV在猪群中广泛传播，并且毒株具有高度的遗传多样性。此外，还鉴定出新的PHEV变种，可引起青年和成年猪的呼吸道疾病。

3.3.4. 猪δ冠状病毒

猪δ冠状病毒或PDCoV于2012年首次在香港鉴定，是禽类和哺乳动物冠状病毒分子遗传监测的结果。然而，直到2014年，其對猪的致病作用才被知晓。2014年，PDCoV被确定为腹泻爆发的病原体，该爆发始于美国俄亥俄州，并迅速蔓延到其他20个州。随后几年，PDCoV在許多國家被記錄，如加拿大、秘魯、墨西哥、日本、中國大陸、泰國、越南、老撾和韓國，給養豬業造成重大經濟損失。PDCoV引起的症状与PEDV和TGEV相似。这些包括呕吐、脱水和腹泻。感染仔猪的死亡率约为30%–40%。然而，PDCoV与其他猪冠状病毒（PEDV、TGEV和/或轮状病毒）的共感染可能导致更严重的后果。

基于全长基因组的流行病学研究（收集了15年间的119个分离株）确定了四个PDCoV系统发育谱系，具有不同的地理分布。“泰国”谱系包括在越南、老挝和泰国发现的毒株。“早期中国”和“中国”谱系由 exclusively 在中国境内循环的毒株代表，而“美国”谱系汇集了在美国鉴定并随后传播到日本、韩国和中国的毒株。进一步的研究和毒株基因组分析（166个分离株）能够区分两个基因群，GI和GII，它们分别分为七个（GIa-g）和两个（GIIa, GIIb）亚组。中国分离株在所有亚组中都有代表，并且显示出比来自其他地区的分离株更频繁的重组和更高的遗传多样性。

有证据表明PDCoV能够进行种间传播，并可在各种动物中引起疾病。特别是，已记录了小鼠的实验性PDCoV感染、犊牛以及家禽（鸡和火鸡）的实验性感染，随后传播给健康个体。此外，在野生鸟类、亚洲豹猫和獾的粪便中鉴定出了PDCoV。此外，已发现PDCoV能够感染来源于公牛、鸡、狗和人的各种细胞系，包括人肠道上皮细胞。最近，在加勒比海北部岛国海地的农村地区记录了PDCoV向人类的种间传播。在Lednicky等人2021年进行的一项研究中，从患有急性未分化发热性疾病的儿童的血浆样本中检测到三种PDCoV毒株，时间在2014年至2015年之间。据推测，PDCoV在人群