KCC3缺失对远曲小管响应饮食钾摄入减少的非必要性研究

本研究发现，特异性敲除远曲小管（DCT）细胞中的KCC3虽可降低钠氯协同转运蛋白（NCC）的mRNA和蛋白（包括磷酸化形式）表达水平，但在标准或低钾饮食条件下均未破坏整体钾（K+）稳态。研究提示KCC3可能参与NCC的基础表达调控，但对DCT适应低钾状态并非必需，为理解钾平衡调节机制提供了新视角。

　　

引言

远曲小管（DCT）在维持机体钾（K⁺）平衡中发挥关键作用。DCT功能异常可导致如Gitelman综合征和家族性高钾性高血压等疾病，其特征为钾平衡紊乱。过去十年的研究揭示了DCT转运调节钾平衡的重要机制，其中内向整流钾通道Kir4.1的作用尤为突出。血液K⁺水平降低可增加DCT细胞中Kir4.1介导的基底外侧K⁺流，引起膜超极化，降低细胞内氯离子（Cl^?）浓度，进而激活无赖氨酸激酶-Ste20相关脯氨酸丙氨酸丰富激酶-钠氯协同转运蛋白（WNK-SPAK-NCC）信号通路，增强DCT对钠（Na⁺）的重吸收。尽管DCT本身不直接参与K⁺的分泌或重吸收，但增加的Na⁺重吸收会减少Na⁺向远端连接小管的输送，从而最小化尿钾丢失，有助于维持整体K⁺平衡。

然而，这一模型并未解释电中性K⁺-Cl^?协同转运在DCT生理中的作用。早期的微穿刺研究提示K⁺-Cl^?协同转运蛋白（KCC）在DCT钾转运中起关键作用。后续在兔和啮齿类中的研究在远端肾单位（包括DCT）中鉴定出KCC4亚型，并在大鼠和小鼠肾脏中观察到KCC3和KCC4的蛋白表达。一项全面的DCT数学模型提出，沿基底外侧膜的电中性KCl协同转运对DCT功能至关重要，该模型表明KCC家族成员是主要的基底外侧K⁺出口途径，但具体的KCC亚型尚未确定。

KCC3在多个肾单位节段表达，近期研究强调了其在β闰细胞功能中的作用。尽管小鼠全身性KCC3敲除并未导致显著的血钾异常，但KCC3在神经元和血管等其他组织中的作用使这些结果的解读复杂化。为深入探索KCC3在DCT功能中的角色，研究人员创建了一种在DCT细胞中特异性敲除KCC3的新型动物模型。

材料与方法

所有动物实验均遵循范德比尔特大学医学中心（VUMC）机构动物护理和使用委员会的指南并获其批准。KCC3 floxed（KCC3^f/f）动物由Delpire实验室先前报道，并将其与在NCC启动子控制下表达Cre的小鼠（NCC-Cre）杂交，后者亦有报道。研究使用雄性小鼠，所有小鼠均为C57BL/6背景。由此创建了DCT特异性KCC3敲除（KCC3^f/f Cre⁺）小鼠。所有小鼠在实验前后均通过Transnetyx基因分型对尾尖DNA进行PCR基因分型。所用实验小鼠在6-8周龄时连续5天腹腔注射他莫昔芬（120 mg/kg），并使用前至少恢复10天。实验时动物年龄为8-12周。

为确认KCC3重组，采用基因组PCR技术。使用含25 mM NaOH和0.2 mM EDTA的溶液在95°C下消化小块肾皮质1小时，中和后取组织裂解液进行PCR反应。引物设计可检测重组后 exon 7 的缺失（片段从822 bp缩短至256 bp）。通过RT-PCR确认肾脏中重组转录本的存在，使用跨 exon 6/8 至 exon 9 的引物，仅在敲除动物中产生470 bp片段。同时从脑和肌肉（已知高表达KCC3的器官）分离RNA，以确认重组仅发生在肾脏。

动物饲养采用标准饲料（含1.21% K⁺和0.99% NaCl）或缺钾饲料（含15-30 ppm K⁺、0.3% Na⁺和0.45% Cl^?）。通过代谢笼收集点尿样，使用CareLyte Plus分析仪测定尿电解质浓度，并以尿肌酐浓度标准化。氢氯噻嗪（HCTZ）反应测试通过口服25 mg/kg剂量后进行3小时尿液收集分析。血液电解质通过心脏穿刺取样，使用iSTAT分析仪或CareLyte Plus分析仪测量。

免疫荧光实验使用甲醛固定肾脏组织，脱水石蜡包埋后切片，进行抗原修复和一抗孵育，DAPI核染色，荧光显微镜观察拍摄。抗体列表包括pNCC-T53、pNCC-T46、总NCC、Kir4.1、pSPAK-S373/pOxSR1-S325、tSPAK、WNK4、Calbindin、Parvalbumin和Actin等。Western blot采用肾组织裂解液，BCA法测蛋白浓度，4-20% Bis-Tris凝胶电泳。定量PCR使用TaqMan系统，以RPS18为内参基因计算相对基因表达。数据以均值±标准差表示，采用双尾非配对Student t检验或双因素方差分析进行统计比较。

结果

通过重新分析已报道的DCT富集单核RNA测序数据集（GSE228367），量化KCC亚型在DCT中的表达。Slc12a4（KCC1）和Slc12a5（KCC2）在DCT细胞中转录本丰度较低。Slc12a6（KCC3）和Slc12a7（KCC4）在DCT1、DCT2和增殖DCT亚群中表达较高。Slc12a6在DCT1、DCT2和增殖DCT细胞中的表达比例分别为32.2%、34.4%和57.1%，而Slc12a7的表达比例分别为17.3%、15%和14.3%。

由于Slc12a6（编码KCC3）表达最高，研究人员特异性敲除了DCT中的KCC3。将KCC3 floxed（KCC3^f/f）动物与表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶（由NCC启动子驱动）的小鼠杂交，获得DCT特异性KCC3敲除动物（KCC3^f/f Cre⁺，敲除型）和同窝对照（KCC3^f/f Cre^?，对照型）。通过针对Slc12a6 exon 7（两侧为loxP位点）的引物组对肾脏基因组DNA进行PCR，确认重组成功。RT-PCR使用特异性识别 exon 6/8 连接点的修饰引物和 exon 9 内的反向引物，仅在敲除动物中产生产物。Cre表达仅限于这些小鼠中表达NCC的细胞，表明该转录本对DCT具有特异性。重组仅在肾脏中检测到，而在脑和肌肉中未发现，证实了模型的肾脏特异性。

先前研究表明，NCC-Cre转基因表达本身不改变肾脏NCC蛋白水平。为确认这一点，研究人员量化了未他莫昔芬诱导的Cre^?和Cre⁺小鼠肾脏中的总NCC丰度，未观察到显著差异。基线表型分析进一步显示，在标准饮食条件下，对照和敲除动物之间的血液电解质浓度（包括Na⁺、K⁺、Cl^?和HCO₃^?）无差异。肾脏重量在基因型间也具有可比性。

为体内评估NCC活性，对正常饮食维持的对照和敲除动物进行HCTZ反应测试。HCTZ处理后，基因型间尿Na⁺和K⁺排泄无差异。尽管无生理差异，但敲除动物中磷酸化和总NCC丰度较对照降低。Slc12a3转录本丰度在敲除动物中也减少。未检测到Kir4.1或调节NCC的激酶（包括总SPAK、磷酸化SPAK/OxSR1或总WNK4）的丰度差异。为确定KCC3缺失是否影响总DCT丰度或其亚段，通过Parvalbumin（DCT1）和Calbindin（DCT2）染色测量DCT1和DCT2面积。未检测到基因型间DCT1、DCT2或总DCT面积的差异。

为确定KCC3对降低K⁺摄入的DCT反应是否必需，将对照和敲除动物维持无钾饮食4天，并测量对K⁺限制的生理反应。在治疗期间，未检测到对照小鼠与敲除小鼠在尿Na⁺或K⁺排泄或尿Na⁺-K⁺比率方面的差异。实验结束时，血液Na⁺、K⁺、Cl^?或HCO₃^?水平或肾脏重量也无差异。

生理学数据表明KCC3不是饮食K⁺限制的DCT反应所必需。为证实这一点，对无钾饮食处理后两种基因型的肾脏进行Western blot分析。未检测到总或磷酸化NCC、总或磷酸化SPAK或WNK4丰度的差异。此外，K⁺限制后Slc12a3转录本丰度无差异，表明在蛋白和转录水平上均正常化。近期报道表明，低K⁺反应中的DCT活化伴随WNK体的形成，这些分子凝聚物假设参与NCC活化。为确定KCC3是否参与WNK体的形成，对对照和敲除动物进行WNK4免疫荧光染色。敲除动物保留DCT细胞形成WNK体的能力，与KCC3不是DCT对减少K⁺摄入反应的关键组成部分的其他数据一致。

讨论

研究人员长期致力于揭示DCT转运调节的分子机制。显著进展阐明了该系统的关键组成部分，包括WNK/SPAK/NCC信号级联。该通路对基底外侧K⁺水平高度敏感，钾通道Kir4.1（与Kir5.1形成异源多聚体通道）通过改变通道流和细胞内Cl^?浓度启动电化学-激酶信号，作为关键调节器。尽管通过Kir4.1的生电K⁺外流至关重要，但研究也指出电中性KCl协同转运在维持DCT功能中的作用。本研究调查了电中性KCl协同转运蛋白KCC3在DCT转运中的功能。研究人员生成了一种DCT特异性KCC3敲除模型，并评估其缺失在标准和K⁺限制饮食条件下对电解质处理和信号传导的影响。

在标准饮食条件下，DCT细胞中KCC3的缺失导致总NCC和磷酸化NCC蛋白减少，以及NCC mRNA表达降低。尽管存在这些分子变化，KCC3缺陷小鼠仍维持正常的血液电解质水平。未观察到总DCT质量或亚段丰度的变化。当 challenged 无钾饮食时，敲除动物与对照反应相似——在尿液或血液电解质、NCC活化或DCT内WNK体形成方面无差异。尽管KCC3似乎影响基线NCC表达，但它对DCT适应K⁺耗竭的反应是可丢弃的。

研究结果表明KCC3在NCC表达的基础调节中发挥作用。已知KCC3由细胞体积增加激活，先前工作表明KCC3对维持细胞体积稳态至关重要，尤其是在渗透胁迫下。在基底外侧渗透变化可扰动细胞体积的DCT中，KCC3可能通过体积调节帮助调节NCC转录本表达。尽管在KCC3缺失情况下观察到NCC蛋白和mRNA水平降低，但将KCC3介导的体积调节与NCC表达联系起来的精确通路仍不清楚。需要进一步研究来调查细胞体积变化在此过程中的贡献。

研究使用NCC-Cre小鼠进行DCT特异性KCC3缺失，这提出了一种可能性，即Cre表达本身可能影响NCC转录本和蛋白表达。然而，Cornelius等人先前工作表明，Cre表达不影响这些小鼠中的NCC mRNA或蛋白丰度。这些发现被后续研究证实，研究人员再次证明，在他莫昔芬处理缺失的情况下，NCC-Cre转基因表达不影响NCC蛋白丰度。这支持了观察到的NCC表达变化是由于KCC3缺失而非Cre重组酶的混杂效应的结论。

尽管KCC3缺失降低了基础条件下的NCC丰度，但并未损害对K⁺耗竭的DCT适应性反应。这表明KCC3对由低K⁺状态触发的NCC活性补偿性增加并非必需。一种解释是，电中性KCl转运机制（如KCC3）根本就不是DCT对K⁺耗竭反应所必需的——这一观点与当前强调低钾血症期间膜电压调节NCC活性的模型一致。或者，另一种KCC亚型可能补偿KCC3的缺失。基于RNA测序数据和先前文献，KCC4是一个强有力的候选者。若干RNA测序数据集报道Slc12a7（KCC4）是DCT细胞中表达的主要KCC家族成员。尽管结果显示Slc12a6（KCC3）的转录本丰度较高，这可能反映了数据集的独特DCT富集性，但Slc12a7是第二丰富的亚型。鉴于KCC3在DCT对低K⁺反应中缺乏功能性作用，生成DCT特异性KCC4敲除模型可能有助于澄清其贡献，并确定是否是KCC4而非KCC3在K⁺耗竭期间调节NCC活性。关于KCC4在此过程中起重要作用的假设纯属推测，但新的动物模型可能有助于澄清这个未解决的问题。

总之，尽管研究发现表明KCC3参与DCT中NCC表达的基础调节，但它对K⁺限制的适应性反应并非必需。研究结果突出了肾脏中K⁺转运的复杂性，并表明KCC4可能在K⁺耗竭期间调节NCC中发挥更突出的作用。这些见解为理解控制电解质稳态的分子机制提供了重要线索，并提示了研究其他KCC亚型在DCT功能中的未来方向。

局限性

所有实验均在8-12周龄雄性小鼠中进行，肾脏健康。需要进一步研究以确定这些发现是否适用于雌性小鼠、老年动物或肾损伤模型。本研究中的对照动物为Cre阴性 floxed 小鼠。尽管先前研究和当前数据表明转基因表达本身不改变NCC蛋白丰度，但不能完全排除Cre系统泄漏的可能性。在未来的实验中包括Cre阳性非floxed对照可能有助于解决这一问题，包括是否由于泄漏重组激活补偿机制。正常和无钾饮食条件下的实验分开进行。因此，尽管可以在每个饮食条件下比较基因型，但研究设计不允许评估基因型与饮食K⁺水平之间的相互作用（二乘二分析）。尽管推测KCC4可能在DCT功能中起重要作用，但这需要未来的研究。最后，尽管Western blot分析未揭示总SPAK或磷酸化SPAK/OxSR1的差异，但未对DCT小管进行免疫染色，留下在NCC阳性细胞中特定的变化被非DCT节段中的表达掩盖的可能性。

数据可用性

数据将在合理请求下提供。

资助

这些研究得到NIH基金DP5-OD033412（致A.S.T.）、DK093501（致E.D.）、DK51265、DK95785、DK62794、DK7569和P30DK114809（致R.C.H.和M.-Z.Z.）、K08-DK135931（致J.P.A.）和退伍军人事务功绩奖00507969（致R.C.H.）的支持。F.B.由K08（DK134879）支持。J.P.A.是Robert Wood Johnson基金会Harold Amos医学教师发展计划学者。

利益冲突

作者声明不存在任何财务或其他方面的利益冲突。

作者贡献

J.P.A.、D.H.E.、M.-Z.Z.、R.C.H.、E.D.和A.S.T.构思并设计研究；M.-K.I.、A.Y.、M.Z.F.、Y.Z.、X.-T.S.、K.Y.C.和A.S.T.进行实验；M.-K.I.、M.Z.F.、X.-T.S.和A.S.T.分析数据；M.-K.I.、M.Z.F.、X.-T.S.、F.B.、J.P.A.、D.H.E.、M.-Z.Z.、R.C.H.、E.D.和A.S.T.解释实验结果；X.-T.S.和A.S.T.制备图表；E.D.和A.S.T.起草手稿；X.-T.S.、F.B.、J.P.A.、K.Y.C.、D.H.E.、M.-Z.Z.、R.C.H.、E.D.和A.S.T.编辑和修订手稿；M.-K.I.、A.Y.、M.Z.F.、Y.Z.、X.-T.S.、F.B.、J.P.A.、K.Y.C.、D.H.E.、M.-Z.Z.、R.C.H.、E.D.和A.S.T.批准最终版本手稿。

作者注

通讯作者：A. S. Terker ([e-mail])。