跟腱亚腱体内功能与形态学的跨截面及纵向特征：超声联合神经肌肉电刺激新方法

本刊推荐：本研究创新性地结合横向平面超声成像与神经肌肉电刺激（NMES）技术，首次在体量化了健康个体跟腱内内侧腓肠肌（GM）与外侧腓肠肌（GL）亚腱的差异性滑动行为（P < 0.0001）。该方法证实了亚腱功能在跟腱长度（P = 0.004）和截面空间上的异质性，展现了极高的会话间可靠性（ICC > 0.74）且无双侧差异，为跟腱损伤后功能评估提供了全新的可靠工具。

　　

引言

跟腱是一个由三个独立的筋膜束或称为亚腱（subtendons）构成的复杂结构，它们分别起源于小腿三头肌中的内侧腓肠肌（medial gastrocnemius, GM）、外侧腓肠肌（lateral gastrocnemius, GL）和比目鱼肌。在健康肌腱中，这些亚腱在肌肉收缩时会彼此相对滑动。然而，这种滑动在老年人和跟腱损伤个体中会减弱。由于在低负荷 scenarios 下量化亚腱滑动极具挑战性，尤其是在监测机械性能受损肌腱（如跟腱断裂修复后）的生物力学时，开发可靠的在体表征方法至关重要。本研究旨在利用横向平面超声成像结合个体腓肠肌的神经肌肉电刺激（neuromuscular electrical stimulation, NMES），开发一种可靠的方法来在体表征亚腱的行为。

方法

受试者与实验设计

15名健康成年受试者（7男8女，年龄25±2岁）参与了本研究。他们俯卧于床上，腿部完全伸展，踝关节处于中立放松位。使用一个21-MHz的线性超声探头，通过定制的3D打印夹具固定，以垂直于游离腱的方向获取横向平面超声图像。

神经肌肉电刺激与数据采集

将水凝胶电极对置于GM和GL肌腹最突出部位，使用恒流刺激器输送单相脉冲串（100 Hz, 400 μs脉冲宽度, 1 s持续时间）。刺激强度从4 mA开始，逐步增加直至出现可见的足跖屈，然后降低1-2 mA至无可见跖屈但超声视频中仍可见局部腱位移，以确保目标肌肉的孤立募集，并通过肌电图（electromyography, EMG）测量确认。

将超声探头置于内踝近端1 cm处，分别对GM和GL肌肉进行刺激。随后，将探头沿游离腱向近端腓肠肌腱腱交界处移动1 cm，重复肌肉刺激。在双腿的五个不同肌腱长度位置重复此步骤。

图像处理与数据分析

使用Kanade–Lucas–Tomasi点追踪算法量化刺激过程中的肌腱位移。随后，应用k-均值聚类（k= 3）根据横截面内的累积位移来表征异质的亚腱行为。选择具有最大平均累积位移的聚类进行进一步分析。将点运动表示为肌腱横截面上的异质矢量场，以评估肌腱对每次刺激的功能响应。

统计分析

使用重复测量方差分析（ANOVA）检验刺激肌肉和成像位置对点聚类位置、面积和位移方向的影响。使用配对t检验比较双腿之间的聚类参数。使用组内相关系数（intraclass correlation coefficient, ICC）评估该方案的会话间测量可靠性。

结果

亚腱运动学

跟腱的位移模式因受刺激的肌肉和沿肌腱长度的成像位置而异。受刺激肌肉对峰值位移方向有主效应（P= 0.0003），并且受刺激肌肉与成像位置之间存在显著的交互效应（P= 0.0296）。事后检验显示，在成像位置2、3、4和5，GM和GL刺激引起的位移方向存在显著差异。Friedman检验显示，GL刺激在位置1的累积位移显著小于在位置3、位置4和位置5的位移（P< 0.01）。GM刺激沿肌腱的累积位移无差异。

亚腱形态学

GM和GL肌肉的刺激位移了肌腱横截面的不同区域。受刺激肌肉对聚类内外侧位置有主效应（P= 0.0058），并且受刺激肌肉与成像位置之间存在交互效应（P< 0.0001）。事后比较显示，在成像位置3、4和5，聚类内外侧位置存在差异。受刺激肌肉对聚类前后位置也有主效应（P= 0.0006），在多个成像位置存在差异。沿游离腱的成像位置对聚类面积分数有显著主效应（P= 0.0429），并且存在交互效应（P= 0.0361）。平均而言，内侧腓肠肌聚类占跟腱横截面积的33.3%，外侧腓肠肌聚类占31.6%。

双侧比较

跟腱横截面积、宽度和厚度在左右侧之间无显著差异。对于GL或GM刺激，聚类 centroid 位置在左右腿之间无差异，任何刺激条件下的聚类面积分数在左右侧之间也无显著差异。

可靠性

该工具在踝关节中立位识别GL和GM刺激响应的聚类位置方面表现出极高的会话间可靠性（ICC > 0.746），在20°跖屈位表现出中等可靠性（ICC > 0.598）。在识别聚类面积分数方面可靠性为低至中等（ICC < 0.433）。

讨论

本研究开发了一种在体表征腓肠肌亚腱在肌腱横截面内和沿肌腱长度方向的功能和形态学的方法。结果支持了最初的假设：跟腱对个体肌肉刺激的反应沿其长度和横截面存在差异，健康年轻成年人的左右腿亚腱行为无显著差异，并且该方法在不同测试会话间可靠地识别了局部肌腱位移区域。

运动学数据为了解在体亚腱功能提供了新视角，观察到的位移主要在内侧-外侧方向存在差异，这可能是由于GM和GL肌肉的解剖位置所致。在游离腱近端区域观察到更大的累积位移值，这表明与插入点附近相比，近端游离腱中亚腱间的 interfascicular 连接更少。

相邻亚腱之间的负荷分配（load-sharing）可能影响了结果。受刺激肌肉的亚腱通过 interfascicular matrix 产生的摩擦力“拉动”其相邻组织。GL和GM刺激下不同的肌腱反应也可能源于肌肉生理学的固有差异。

虽然该工具主要侧重于量化亚腱间的负荷分配，但结果与先前检查亚腱形态学的研究结果相似。本研究发现的聚类面积落在先前报道值的范围内。沿肌腱长度聚类内外侧位置的差异可能反映了跟腱的扭曲形态学。

本研究发现的聚类位置与先前工作不同，可能是由于数据处理方法的差异。本研究应用了无监督的k-均值和基于密度的聚类来定义感兴趣的聚类，这种方法对研究者相对亚腱位置的偏见具有鲁棒性，并且证明了该方法具有中等到高度的可重复性。

左右腿之间亚腱行为无差异的发现可能与固有的解剖对称性有关。这一行为是一个重要的临床发现，因为它允许将未受伤的对侧肢体用作损伤后亚腱行为改变的参考。

该工具在中立位和跖屈位均表现出中等到高度的ICC值，证明它能在不同的张力水平下反复捕获预期的肌腱行为。在跖屈位可靠性较低可能是由于肌腱内张力降低，导致对相同刺激强度的位移更大，从而增加了平面外运动的可能性。

研究局限与展望

本研究存在几个局限性。首先，跟腱的轴向成像易受平面外运动的影响。其次，未采集额外的形态学测量（如肌腱长度）。第三，本研究证明了双侧无差异，但未明确评估双侧对称性，且样本量不足以进行等效性分析。最后，仅刺激了健康年轻成年人的GL和GM肌肉，限制了对所有三个小腿三头肌肌肉进行刺激或评估受伤/老化肌腱的理解。

未来的工作应纳入所有三个小腿三头肌的孤立刺激，并评估跟腱受伤的个体。使用更渐进的刺激范式，在更长时间内达到相同的肌肉收缩幅度，将增加具有独特肌腱位移的超声帧数。

结论

本研究开发了一种可靠的方法，使用 combined NMES 和横向平面超声来表征健康受试者的跟腱亚腱行为。结果增加了先前关于肌腱在孤立肌肉收缩响应中异质性的证据。该方法可能揭示健康肌腱和受伤肌腱之间的差异，为跟腱功能提供生物标志物，并进一步探索其在阐明在体亚腱结构方面的应用。

数据可用性

本研究中使用的所有数据均可向通讯作者索取。

补充材料

补充图S1、S2和S3可在 Figshare 获取。

致谢

作者感谢Maggie Wagner在肌电图数据收集和处理方面的协助。

资助

本研究得到了美国国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases）基金P50AR080581（予J.R.B.）和美国国家科学基金会（National Science Foundation）基金DGE-2236662（予K.S.S.）的支持。

利益冲突

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

作者贡献

K.S.S., T.J.H., 和 J.R.B. 构思并设计了研究；K.S.S. 进行了实验；K.S.S. 分析了数据；K.S.S. 解读了实验