碳酐酶IX靶向的铜掺杂碳点作为治疗三阴性乳腺癌的诊疗探针

《Chemical Communications》：Carbonic anhydrase-IX targeted copper-doped carbon dots as a theranostic probe for treating triple negative breast cancer

靶向过氧化氢酶-IX的铜掺杂碳点实现三阴性乳腺癌诊疗与高效杀伤。通过表面修饰醋唑胺，构建的CuCD-Az纳米探针可特异性靶向CA-IX高表达的TNBC细胞，利用Cu2?催化Fenton反应产生活性氧（ROS），在抑制GSH抗氧化系统的同时实现肿瘤微环境内高效ROS累积，使癌细胞死亡率达90%以上，而对正常细胞损伤降低3倍。该材料兼具荧光诊断和化学动力治疗双重功能，突破传统疗法靶向性差、副作用大的瓶颈。

　　在当前癌症治疗领域，乳腺癌作为全球范围内的重大健康挑战之一，其发病率和死亡率一直居高不下。其中，三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）因其缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达，被认为是一种更具侵袭性和治疗难度的亚型，占所有乳腺癌病例的大约15%至20%。由于TNBC缺乏传统靶向治疗药物的结合靶点，常规的化疗和放疗往往伴随着严重的副作用，且难以实现对肿瘤细胞的精准打击。因此，开发具有诊断和治疗双重功能的靶向性探针，成为提升乳腺癌治疗效果的重要方向。

近年来，碳点（Carbon Dots, CDs）作为一种新型的纳米材料，因其优异的荧光性能、良好的生物相容性以及可调控的表面官能团特性，在生物医学领域展现出巨大的应用潜力。碳点不仅能够用于生物成像和药物递送，还因其在化学动力学治疗（Chemodynamic Therapy, CDT）中的作用而备受关注。CDT是一种通过模拟芬顿反应（Fenton-like reaction）将细胞内过氧化氢（H?O?）转化为活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）以诱导癌细胞凋亡的新型治疗策略。ROS在细胞内具有高度的反应活性，能够破坏细胞内的关键生物分子，如DNA、蛋白质和脂质，从而导致细胞死亡。然而，癌细胞内部富含一种天然抗氧化剂——谷胱甘肽（Glutathione, GSH），它能够中和ROS，降低CDT的治疗效果。因此，如何有效降低GSH的浓度，从而增强ROS的生成，成为CDT研究中的关键问题。

为了克服这一挑战，研究者们开始探索引入金属离子作为催化剂，通过其氧化还原反应特性促进GSH的消耗，进而提升ROS的生成效率。铜离子（Cu2?）因其在细胞内能够催化GSH转化为二硫键（GSSG），并且自身在反应中被还原为Cu?，从而进一步与H?O?反应生成更多ROS，展现出良好的CDT潜力。基于这一机制，铜掺杂的碳点（CuCD）被设计为一种具有CDT功能的新型纳米材料。为了增强其靶向性，研究团队进一步在碳点表面修饰了乙酰唑胺（Acetazolamide, Az），这是一种能够特异性结合碳ic anhydrase-IX（CA-IX）的抑制剂。CA-IX是一种在多种肿瘤细胞中高表达的锌依赖性金属酶，尤其在TNBC细胞中更为显著。它通过催化二氧化碳（CO?）与水的可逆反应，调节细胞内外的pH平衡，从而促进肿瘤细胞的存活和转移。因此，将CA-IX作为靶点，结合铜离子的CDT功能，有望开发出一种高效、特异的治疗策略。

本研究中，研究人员合成了一种CA-IX靶向的乙酰唑胺功能化铜掺杂碳点（CuCD-Az），并对其性能进行了系统评估。首先，通过水热法合成了一系列具有羧基富集表面的碳点（CD），并进一步引入铜离子，制备出铜掺杂碳点（CuCD）。随后，利用EDC-NHS偶联反应，将乙酰唑胺分子修饰到碳点表面，使其能够特异性识别并结合CA-IX，从而实现对TNBC细胞的靶向性。实验结果显示，CD-Az和CuCD-Az的粒径均约为3–5纳米，通过透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）图像验证。同时，通过紫外-可见吸收光谱（UV-vis）和荧光光谱分析，证实了乙酰唑胺的成功修饰以及碳点的荧光特性。CD-Az在350纳米波长激发下，其荧光发射峰位于455纳米左右，而CuCD-Az则略有红移至460纳米，显示出铜掺杂对碳点光学性质的影响。

进一步的X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析进一步支持了乙酰唑胺分子在碳点表面的结合。XPS结果显示，CuCD-Az中含有硫元素，这表明乙酰唑胺的修饰成功。FTIR分析则显示了碳点表面存在特征的S–O键振动峰，进一步验证了其结构完整性。此外，X射线衍射（XRD）分析表明，CD-Az和CuCD-Az均表现出非晶态结构，这为其在生物环境中的稳定性和应用提供了保障。

为了验证CuCD-Az的CDT能力，研究人员通过与GSH的反应，观察其对细胞内ROS生成的影响。实验中使用了DTNB（5,5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸）作为检测探针，其在325纳米波长下具有较高的吸收能力。当GSH与DTNB反应时，会生成TNB（5-巯基-2-硝基苯甲酸），其在410纳米波长下具有明显的吸收。而Cu2?则能够催化GSH转化为GSSG，这种产物无法与DTNB反应，因此导致TNB的吸收峰降低。实验结果显示，随着CuCD-Az浓度的增加，TNB的吸收峰逐渐减弱，而DTNB的吸收峰则增强，这表明CuCD-Az能够有效消耗GSH，从而提升ROS的生成效率。在200微克/毫升的CuCD-Az浓度下，几乎检测不到TNB的吸收，说明GSH已被完全转化为GSSG，进一步验证了CuCD-Az在CDT中的高效性。

为了评估CuCD-Az对TNBC细胞的靶向性，研究人员通过Western blot分析确认了CA-IX在MDA-MB-231和4T1细胞中的高表达水平，而正常细胞（如HEK-293和NIH3T3）则表达较低。随后，通过荧光显微镜和流式细胞术（Flow Cytometry）观察到，CD-Az在TNBC细胞中表现出显著的荧光信号，而在正常细胞中则较弱。这表明CD-Az能够通过与CA-IX的特异性结合，实现对TNBC细胞的靶向识别和摄取。同时，通过预处理细胞，研究人员进一步验证了CD-Az的靶向性依赖于CA-IX的表达，当CA-IX被乙酰唑胺阻断后，CD-Az的摄取显著减少，说明其靶向机制是基于CA-IX的结合。

在细胞毒性方面，MTT实验显示，CD和CD-Az在3毫克/毫升浓度下对所有细胞系均表现出约80%的细胞存活率，表明其具有良好的生物相容性。然而，当使用CuCD-Az时，其对TNBC细胞的杀伤效果显著增强，达到约3倍于正常细胞的水平。这一结果表明，CuCD-Az不仅能够通过CDT机制诱导癌细胞凋亡，还能在细胞内有效降低GSH水平，从而提高ROS的生成效率。此外，DCFH-DA染色实验进一步证实了CuCD-Az在TNBC细胞中能够产生大量ROS，而CD-Az则未表现出显著的ROS生成能力，说明铜掺杂对于增强CDT效果至关重要。

综上所述，本研究成功开发了一种具有CA-IX靶向功能的乙酰唑胺修饰铜掺杂碳点（CuCD-Az），该材料不仅具备良好的生物相容性和靶向识别能力，还能够通过CDT机制高效诱导TNBC细胞凋亡。通过结合CA-IX的高表达特性与铜离子的催化作用，CuCD-Az在乳腺癌治疗中展现出广阔的应用前景。未来，随着对这类材料的进一步优化和临床转化研究，有望为TNBC患者提供一种更安全、更有效的治疗方案。