父母染色体状态对年轻复发性流产患者整倍体囊胚发育阶段与形态分级在妊娠结局中的差异化影响研究

本综述深入探讨了年轻复发性流产（RPL）患者中，父母染色体状态（平衡易位BCT vs. 正常核型）如何差异化影响整倍体囊胚的发育阶段（D5/D6）与形态分级（优质/不良）对单颗冻融整倍体囊胚移植（SE-FBT）后妊娠结局的作用。研究通过回顾性队列分析（n=449 cycles）发现：BCT携带者的成功结局主要取决于囊胚发育速度（D5显著优于D6，aOR=2.90），而正常核型患者则更依赖形态分级（优质囊胚显著提升活产率LBR，aOR=1.76）。这一发现为RPL患者的个性化胚胎选择策略提供了重要循证依据。

　　

引言

复发性流产（RPL）定义为妊娠24周前连续发生两次及以上流产，是一种病因复杂的临床难题，其中胚胎染色体异常约占50-60%。随着辅助生殖技术的发展，植入前遗传学检测（PGT）已被广泛应用于筛选整倍体囊胚，显著提高了妊娠成功率并降低了流产风险。然而，即便在整倍体囊胚移植后，部分RPL患者仍面临植入失败或反复流产的困境。现有文献关于整倍体囊胚形态分级和发育阶段（第5天D5 vs. 第6天D6）对妊娠结局的影响存在争议，且缺乏针对RPL这一特殊人群的深入研究。尤为重要的是，染色体平衡易位（BCT）作为RPL患者中最主要的细胞遗传学异常（占1-5%），其携带者的整倍体率显著降低（26% vs. 正常核型40%），但尚无研究探讨父母染色体状态是否会调制整倍体囊胚特征与移植结局之间的关联。本研究聚焦年轻RPL患者（年龄<38岁），旨在评估整倍体囊胚参数、父母染色体状态与妊娠结局之间的相互作用，为年轻RPL患者建立基于证据的个性化整倍体囊胚选择方法。

材料与方法

研究设计与人群

这项回顾性队列研究在河南省人民医院生殖医学中心进行，时间跨度为2017年1月至2023年9月，经医院伦理委员会批准。研究系统分析了医院电子病历系统中接受PGT-A或SR以及单颗冻融整倍体囊胚移植（SE-FBT）的RPL患者的临床数据。所有入组的核型正常RPL患者至少有一次流产归因于确认的胚胎染色体异常。

纳入标准包括：1) 夫妻一方携带BCT（包括相互易位和罗伯逊易位）或双方核型正常；2) 女性在周期启动时年龄<38岁；3) 至少完成一个涉及D5/D6囊胚的SE-FBT周期。排除标准包括：1) 高龄（年龄≥38岁）；2) 夫妻双方存在非BCT染色体异常；3) PGT-A/SR周期中使用供体配子；4) 合并单基因疾病或反复植入失败（RIF）；5) 2023年9月前无整倍体囊胚可用或未完成首次FBT。镶嵌型囊胚被系统排除在移植方案外。

治疗方案

卵巢刺激与胚胎培养

采用三种既定的控制性卵巢刺激（COS）方案：1) GnRH激动剂长方案（卵泡早期长效或黄体中期短效）；2) 灵活GnRH拮抗剂方案；3) 孕激素预激卵巢刺激（PPOS）方案。具体方案参数遵循已发表的方法。根据综合临床参数制定个性化COS方案：母亲年龄、体重指数（BMI）、窦卵泡计数（AFC）、抗穆勒氏管激素（AMH）水平、基线卵泡状态、既往卵巢反应及社会经济考量。通过系列阴道超声（TVUS）和血清雌二醇（E₂）监测动态调整促性腺激素剂量。触发排卵标准要求≥1个卵泡≥18mm或≥2个卵泡≥17mm，根据卵泡群特征和峰值E2水平使用人绒毛膜促性腺激素（hCG）（4000-10000IU）和/或GnRH激动剂（0.1/0.2mg）。触发后34-37小时在TVUS引导下取卵。

胚胎实验室操作

所有周期在取卵后4-6小时进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）。受精确认（双原核）在ICSI后16-18小时进行。胚胎在Vitrolife序贯培养基中培养至囊胚阶段，环境控制（37°C，6% CO₂，5% O₂，89% N₂），囊胚分级在活检前进行。由两名经验丰富的胚胎学家使用Gardner标准独立评估囊胚形态，评估扩张程度（1-6期）、内细胞团（ICM）和滋养层（TE）形态（针对3-6期）。扩张分期为：1（早期；囊胚腔<胚胎体积50%），2（囊胚腔≥50%），3（完全；囊胚腔完全填充胚胎），4（扩张；囊胚腔>早期胚胎体积，透明带变薄），5（孵化；滋养层从透明带疝出），6（已孵化；囊胚完全脱出透明带）。ICM评分：A（致密，细胞数多），B（松散分组，细胞数中等），C（细胞稀疏）。TE评分：A（ cohesive，多细胞上皮），B（ fragmented epithelium，细胞数少），C（ minimal，细胞增大）。胚胎分类为：优质：≥3BB级；不良：3-6 AC/BC/CA/CB级。

使用激光辅助系统对达到最低质量阈值（≥3BC/CB）的囊胚进行TE活检。每个囊胚活检5-10个细胞。活检后所有囊胚通过玻璃化冷冻保存。使用MiSeqDx平台通过新一代测序（NGS）进行非整倍体遗传分析。活检细胞使用SurePlex试剂盒进行全基因组扩增，随后使用VeriSeq PGS试剂盒构建文库。在PGT-SR病例中，随后采用新一代测序与显微切割连接区（MicroSeq）分析区分非携带者和平衡携带者胚胎。

单颗整倍体囊胚移植方案

SE-FBT前，所有患者根据既定临床指南接受RPL标准化评估和治疗。确认有整倍体囊胚的患者接受SE-FBT，遵循三种标准化子宫内膜准备方案：1) 自然周期（NC）：适用于周期规律的排卵女性。从周期第10天开始通过TVUS监测子宫内膜发育。排卵日给予孕酮，5天后移植胚胎；2) 激素替代治疗（HRT）：适用于无排卵女性或需要控制性子宫内膜准备者。周期第2-4天开始给予口服戊酸雌二醇片2-4 mg/日，随后根据系列TVUS评估进行剂量滴定（4-8 mg/日），至少11天。子宫内膜厚度≥8 mm或最大雌激素暴露时间21天触发孕酮启动，6天后移植；3) GnRHa-HRT：适用于植入失败或子宫内膜异位症患者。周期第2-4天单剂量GnRHa实现垂体降调节。降调节14天后（确认血清雌二醇<50 pg/mL且无卵巢囊肿>10 mm），按HRT方案进行子宫内膜准备。黄体期支持包括口服地屈孕酮（10mg bid）和阴道孕酮凝胶（90mg qd），维持至妊娠10周。

妊娠结局评估

移植后14天测量血清β-hCG水平。β-hCG≥25 IU/L视为阳性结果。移植后4-5周进行TVUS。结局指标计算如下：1) 临床妊娠率（CPR）：临床妊娠数/移植周期总数×100%；2) 早期流产率（EMR）：临床妊娠<12孕周流产数/临床妊娠总数×100%；3) 活产率（LBR）：分娩≥1个活产婴儿（≥24孕周）/胚胎移植周期数×100%。单次妊娠周期中的多胎分娩记为一次活产事件。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics（版本27.0）进行统计分析。连续变量通过Shapiro-Wilk检验评估正态分布，以均值±标准差（SD）或中位数（四分位距）表示。使用参数和非参数检验（包括Student t检验和Mann-Whitney U检验）进行比较分析。分类变量以频数和百分比（%）表示，使用Pearson卡方检验分析。考虑到同一患者多次数据点，使用广义估计方程（GEE）进行数据分析。采用多变量逻辑回归分析评估胚胎发育阶段和形态分级对妊娠结局的影响。基于单变量回归分析（显著性水平P<0.2）和文献回顾选择潜在混杂变量。结果以调整后优势比（aOR）和95%置信区间（95%CI）表示。P<0.05认为有统计学意义。

结果

研究人群

最终纳入177个来自149个PGT周期的BCT患者FBT周期，和272个来自207个PGT周期的核型正常患者FBT周期。根据发育阶段（D5和D6）和形态分级（优质和不良）分析CPR、EMR和LBR。在BCT周期中，28名患者经历了两个FBT周期；在正常周期中，38名患者有两个FBT周期，12名患者有三个周期，1名患者有四个周期。

BCT周期

PGT周期基线特征见表1。所有纳入患者的BCT亚型详见补充表1。FBT周期参数总结见表2。比较分析显示，D5与D6移植组以及优质与不良质量组在母亲年龄、BMI、既往流产次数、子宫内膜厚度或子宫内膜准备方案上无显著差异（P>0.05）。值得注意的是，形态分级在D5和D6囊胚间存在显著差异（P=0.001），D5组优质囊胚比例更高（55.56% vs. 32.38%）。同时，发育阶段分析显示优质和不良质量囊胚间存在显著差异（P=0.001），优质囊胚主要出现在D5组（54.05% vs. 31.07%）。

表3描述了囊胚发育阶段、形态分级与妊娠结局的关联。D5囊胚的CPR（83.33% vs. 62.86%，P=0.003）和LBR（75.00% vs. 51.43%，P=0.003）显著优于D6囊胚。多变量调整后这些关联仍保持统计学意义（CPR的aOR=2.90，95%CI=1.37-6.13，P=0.005；LBR的aOR=2.60，95%CI=1.26-5.35，P=0.010）。EMR无组间差异（8.33% vs. 12.12%，P=0.502）。

值得注意的是，未经调整的分析显示囊胚形态分级组间结局存在显著差异（优质vs.不良：CPR：81.08% vs. 64.08%，P=0.013；LBR：71.62% vs. 53.40%，P=0.012），但控制混杂因素后这些关联减弱（CPR：aOR=1.80，95%CI=0.84-3.84，P=0.129；LBR：aOR=1.66，95%CI=0.88-3.14，P=0.116）。不同质量类别间EMR相当（8.33% vs. 12.12%，P=0.493）。调整模型纳入了母亲年龄、BMI、AMH水平、既往流产次数、子宫内膜准备方案、子宫内膜厚度以及囊胚发育阶段/形态分级。

进一步分析发育阶段和形态分级对妊娠结局的联合影响（补充表2）。分析显示，发育天数 specifically 在不良质量囊胚中对妊娠结局有显著影响。

正常周期

核型正常RPL患者的PGT周期基线特征见表4，FBT周期参数详见表5。按发育阶段和形态分级分层后，各组在母亲年龄、BMI、既往流产次数、子宫内膜厚度或子宫内膜方案上均无显著差异（所有P>0.05）。

比较分析显示D5和D6囊胚间存在显著形态差异（P=0.022），D5囊胚优质囊胚比例更高（59.68% vs. 46.62%）。重要的是，发育阶段分布在优质与不良质量囊胚间差异显著（P=0.024），优质囊胚中51.75%来自D5，而不良质量组为38.76%。

表6展示了囊胚发育阶段和形态分级与妊娠结局的关联分析。D5和D6囊胚在CPR（68.55% vs. 61.49%，P=0.226）和LBR（50.00% vs. 47.97%，P=0.815）上无显著差异。多变量调整后这些不显著关联仍然存在（CPR：aOR=1.16，95%CI=0.70-1.95，P=0.560；LBR：aOR=1.01，95%CI=0.62-1.65，P=0.968）。D5和D6组间EMR相当（20.00% vs. 20.88%，P=0.882）。

相比之下，囊胚形态分级显著影响生殖结局。优质囊胚组的CPR和LBR显著高于不良质量组（74.13% vs. 54.26%，P<0.001；56.64% vs. 40.31%，P=0.031）。调整潜在混杂因素后这些关联仍保持统计学意义（CPR：aOR=2.46，95%CI=1.46-4.15，P<0.001；LBR：aOR=1.76，95%CI=1.03-3.01，P=0.039）。形态分级组间EMR无显著差异（18.87% vs. 22.86%，P=0.755）。多变量模型考虑了母亲年龄、BMI、AMH水平、既往流产次数、子宫内膜准备方案、子宫内膜厚度以及囊胚发育阶段/形态分级。

进一步评估了发育阶段和形态分级对妊娠结局的联合效应（补充表3）。发现形态分级对妊娠结局有显著影响，尤其是在D6囊胚中。

将数据按母亲年龄（≥35岁 vs. <35岁）分层并比较FET周期基本参数（补充表4）。结果显示仅既往流产次数在两组间差异显著，而母亲BMI、子宫内膜准备方案、子宫内膜厚度、胚胎发育阶段或形态分级无显著差异。此外，分析了每个年龄层内胚胎形态分级和发育阶段对妊娠结局的影响（补充表5）。对于<35岁女性，优质囊胚显著提高CPR（74.77% vs. 57.78%，P=0.010；aOR=2.17）。对于≥35岁女性，优质囊胚显著改善LBR（55.56% vs. 28.21%，P=0.018；aOR=4.56）。胚胎发育阶段不影响任一组的EMR或LBR/CPR。

BCT周期 vs. 正常周期

BCT周期与正常周期基线特征和卵巢刺激参数比较显示，在父母年龄、既往妊娠和流产次数、COS方案类型、Gn使用时长、囊胚形成率、每周期整倍体胚胎产量上存在显著差异（补充表6）。BCT与正常周期FET周期特征和妊娠结局比较进一步显示，母亲年龄、BMI、既往流产次数、囊胚形态分级存在显著差异。其他变量无显著差异（补充表7）。

讨论

本研究重点评估了年轻RPL患者中，囊胚发育阶段（D5 vs. D6）和形态分级对SE-FBT后妊娠结局的影响，患者分别为BCT携带者或核型正常者。在BCT携带者中，观察到D5整倍体囊胚在CPR和LBR上显著优于D6囊胚。然而，囊胚形态学对生殖结局无统计学显著影响。相反，在核型正常RPL患者中，囊胚发育阶段与CPR或LBR无显著相关，而形态分级良好的囊胚表现出明显更好的CPR和LBR。据我们所知，这是此类关联的首次报道。

当前关于整倍体囊胚形态分级与妊娠结局关联的研究存在争议。Capalbo等人报道了PGT-A后不同整倍体囊胚形态分级和发育阶段具有可比着床潜力，Vi?als Gonzalez等人也证实了这一发现。值得注意的是，这些研究涉及的平均年龄在取卵时分别为37.8岁和38.6岁的AMA人群。在年轻人群中，Ji等人报道在平均母亲年龄30岁的PGT-A候选者中，整倍体囊胚特征对CPR和LBR无显著影响。相反，Lou等人观察到在接受PGT-A的35岁以下患者中，优质整倍体囊胚（AA/AB/BA）的着床率优于较差质量囊胚（AC/BC），但样本量相对较小。Cimadomo等人在中位母亲年龄39.6岁的队列中发现了形态学对妊娠结局的显著影响，其中>90%的PGT-A病例是因AMA。此外，来自AMA患者的优质囊胚高比例可能存疑。Irani等人也报道了形态学与结局的相关性，但其研究人群包括所有接受常规PGT-A的不孕患者。我们针对年轻RPL患者的调查揭示了基于父母染色体状态的差异化关联：囊胚形态分级与核型正常病例的妊娠结局相关，但与BCT携带者无关。

关于整倍体囊胚发育阶段对妊娠结局的影响仍在争论中。在接受PGT-M/A的年轻患者（<35岁）中，Liu等人报道发育阶段与妊娠结局无显著关联。相反，Chen等人发现发育阶段与着床率和LBR相关，队列年龄相似（平均母亲年龄30岁），接受PGT/A/M/SR。值得注意的是，两项研究均未明确说明每位患者是单次还是多次FBT周期——这是一个关键的方法学考量，因为同一患者的重复周期可能违反统计独立性假设。Li等人的研究解决了这一分析问题，该研究仅分析了PGT-A后的首次FBT周期，并确定了发育阶段与LBR之间的显著相关性。最近来自PGT-M/SR人群（中位年龄29.7岁）的证据进一步支持发育阶段作为LBR的预测因子。本研究发现，在年轻BCT RPL患者中，囊胚发育阶段与妊娠结局相关，而在年轻核型正常RPL患者中，囊胚发育阶段对妊娠结局无影响。

多种因素可能导致调查整倍体囊胚移植结局的研究中观察到的差异。首先，接受PGT的患者群体存在显著异质性。与接受PGT-M/SR的队列相比，RPL和/或RIF人群的病因 beyond 胚胎染色体异常是多因素的。值得注意的是，RIF患者子宫内膜容受性改变已被充分证明是一个关键混杂因素。此外，与生殖潜力年龄相关下降不仅与非整倍体率增加相关，还反映了胚胎中复杂的代谢和表观遗传修饰。

其次，胚胎分级系统固有的主观性值得考虑。虽然通过标准化协议（例如Gardner标准）可以实现实验室内一致性，但形态评估中存在显著的中心间变异性。第三，滋养层活检操作中的技术变量需要仔细审查。操作者专业知识和持续的质量控制措施至关重要，因为次优的活检技术可能会损害胚胎活力——有研究表明去除过多滋养层细胞（>10个细胞）会降低着床潜力。最后，研究设计的方法学差异值得关注。此外，纳入每位患者的多个胚胎移植周期而未对重复测量进行适当的统计调整可能会增加I类错误率。

本研究揭示，在年轻RPL患者中，整倍体囊胚形态分级和发育阶段对妊娠结局的影响取决于父母染色体状态。在核型正常患者病例中，优质整倍体囊胚可能拥有优化的细胞分化机制、线粒体稳态和代谢活动，从而增强胚胎着床潜力。而D6囊胚可能反映短暂的代谢波动而非内在发育受损，因此显示出与D5囊胚相当的临床结局。相反，来自BCT携带者的整倍体胚胎可能仍存在微缺失/微重复，这些异常可能通过胚胎发育阶段而非形态分级反映出来。D5整倍体囊胚可能反映了更完整的染色体结构修复能力。第5天，囊胚的线粒体DNA（mtDNA）水平显著高于第6天。这表明mtDNA数量可能在决定囊胚发育速度中起关键作用。

值得注意的是，正常周期组中观察到的早期流产率（20.45%，36/176）需要仔细考量。分析显示与胚胎参数（发育阶段/形态分级）、子宫内膜厚度和子宫内膜准备方案无关。关键的是，RPL病史成为流产风险的有力预测因子，流产率随着既往流产负担显著上升：2次流产14.75%，3次22.06%，4次19.35%，≥5次37.50%（≥5次 vs. 2次，P=0.03）。这种剂量依赖关系，与Ni等人的发现一致，表明RPL本身可能诱导子宫内膜病理生理变化， potentially 造成容受性受损的恶性循环。虽然PGT-A规避了非整倍体，但我们的数据证明RPL患者中持续存在子宫内膜功能障碍，严重病例流产率接近37.50%——超过了一些PGT-SR研究中的4.05% - 11.02%。因此，RPL病史是整倍体流产风险的关键指标，强调了解决这一高风险人群子宫内膜容受性的必要性。

此外，在两组基线特征比较中，核型正常组报告的既往流产次数高于BCT组。这种差异也可能导致观察到的两组间整倍体囊胚发育阶段和形态分级对妊娠结局的差异化影响。

优势与局限性

大量研究考察了囊胚发育阶段和形态分级对SE-FBT后LBR的影响。然而，这些调查通常合并了具有各种PGT适应症（如AMA、RIF、RPL等）的异质人群。相比之下，我们的研究 specifically 聚焦于相对同质的年轻RPL人群，并进一步根据父母核型状态（正常核型 vs. BCT）进行分层分析。此外，单中心设计确保了整个研究中胚胎评分的一致性。

尽管努力最小化偏倚，本研究仍有几个固有局限性。其回顾性设计带有不可避免的偏倚风险，而单中心设置和有限样本量限制了统计效力和普适性。此外，在BCT与正常核型周期中观察到基线特征的显著差异，需要考虑人群水平混杂因素作为结局的潜在影响。我们承认这些发现的初步性质；未来需要通过更大队列的多中心研究进行验证，以建立稳健的循证临床指导。

结论

在年轻BCT RPL患者中，整倍体囊胚的发育阶段而非形态分级对妊娠结局有显著影响。相反，在核型正常RPL患者中，囊胚形态分级取代发育阶段成为主要预后因素。这些发现为胚胎选择的临床决策提供了宝贵指导：1) 对于BCT携带者，应优先移植在第5天达到扩张的整倍体囊胚；2) 对于核型正常患者，形态评估应指导选择最佳质量囊胚， regardless of 发育天数。未来的基础研究对于阐明父母染色体状态如何调制整倍体囊胚形态分级和发育阶段与后续妊娠结局之间的关联机制至关重要。