基于1,2,3-三唑衍生物的IDO1抑制剂理性设计及其抗炎镇痛功效研究

本研究通过靶向IDO1酶的血红素活性位点，设计并合成了一系列含1,2,3-三唑结构的2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物。化合物14e展现出最强的IDO1抑制活性（IC50 = 3.63 μM），其通过三唑环与血红素亚铁离子配位、π-π堆积及氢键作用实现高效抑制。体内实验证实14e显著减轻CFA诱导的小鼠神经炎症和疼痛行为，并降低TNF-α与IL-1β水平，安全性良好，为靶向IDO1的抗炎镇痛药物开发提供新策略。

　　

1 引言

疼痛作为机体对潜在组织损伤的警示信号，其慢性化已成为影响全球30%人口健康的重大临床问题。慢性疼痛常伴随睡眠障碍、焦虑抑郁等并发症，现有镇痛药物存在耐受性、依赖性和肝毒性等局限。近年来，色氨酸代谢通路——尤其是色氨酸-犬尿氨酸（Tryptophan-Kynurenine）通路——被证实与疼痛调控密切相关。该通路关键限速酶吲哚胺2,3-双加氧酶1（Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1, IDO1）在炎症刺激下显著上调，催化L-色氨酸分解产生神经毒性代谢物3-羟基犬尿氨酸（3-HK）和喹啉酸（QUIN），导致神经炎症和神经元损伤。同时，色氨酸向5-羟色胺转化减少，进一步加剧抑郁样行为与疼痛恶性循环。因此，靶向IDO1成为镇痛药物研发的新策略。

IDO1为含血红素单聚体酶，其晶体结构（PDB: 4PK5）显示活性中心包含两个结合口袋：疏水性的Pocket A可容纳大分子配体，Pocket B则富含极性残基。已知抑制剂Amg-1的1,2,4-三唑环与血红素铁配位，苯环深入Pocket A形成疏水作用，此模式为理性设计提供了结构基础。1,2,3-三唑环作为五元芳香杂环，具有多重配位位点、π-π共轭特性及大偶极矩，可通过金属配位、氢键和疏水作用与生物受体结合，已广泛应用于抗肿瘤、抗病毒及抗炎药物设计。例如，Hou课题组通过点击化学合成的1,2,3-三唑衍生物（化合物1）对IDO1的IC₅₀达0.59 μM；Yang团队开发的萘醌三唑类化合物2抑制活性达5 nM，且在肺癌和肝癌模型中展现显著抗肿瘤效果。

2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-酮（7）作为低毒性氮氧杂环骨架，具有广泛生物活性。既往研究将其与色氨酸吲哚环融合获得化合物9（hAChE抑制剂）或与5-氟吲哚IDO1抑制剂10结合获得化合物11（多巴胺D2受体抑制剂及5-HT重摄取抑制剂）。然而，此类吲哚类抑制剂仅通过胺基与Ser167氢键作用抑制IDO1，效力较弱。本研究创新性地将可协同血红素铁离子的1,2,3-三唑基团引入苯并恶嗪酮骨架，并引入卤代苄基以增强结合能力，旨在开发新型IDO1抑制剂。

2 化学合成

以6-氨基-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮（12）为起始原料，在HATU和DIPEA催化下与3-乙炔基苯甲酸缩合生成中间体13，继而通过铜催化的点击化学反应与不同取代叠氮化合物反应，合成10个目标化合物（14a-14j）。所有化合物结构经核磁共振氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）确证。

3 结果与讨论

3.1 IDO1抑制活性评价

在高表达IDO1的HeLa细胞模型中，化合物14e表现出最强抑制活性（IC₅₀ = 3.63 μM），优于阳性对照化合物1（IC₅₀ = 0.71 μM），因此被选为后续体内研究候选分子。

3.2 分子对接揭示结合模式

对接研究表明，化合物14e的1,2,3-三唑环定位于血红素正上方，其氮原子与亚铁离子形成配位键，同时与Phe263发生π-π堆积作用。2-氟-6-氯苄基深入疏水Pocket A，而苯并恶嗪酮骨架的酰胺基与Lys238形成氢键，多重相互作用共同保障了高效抑制。

3.3 抑制小胶质细胞激活

在CFA诱导的小鼠炎症模型中，脊髓背角小胶质细胞标志物Iba1表达显著上调。Western blot及免疫荧光结果显示，化合物14e处理显著降低Iba1蛋白水平（P < 0.01），并逆转CFA引起的形态学激活与聚集，表明其有效抑制神经炎症响应。

3.4 缓解炎症性疼痛行为

CFA注射后小鼠出现机械性异常性疼痛（von Frey纤维测试）、热痛觉过敏（热辐射仪测定）及自发性疼痛（抬足与舔爪行为）。化合物14e（30 mg/kg腹腔注射）从12小时起显著降低机械 withdrawal frequency（PWF），延长热 withdrawal latency（PWL），并于72小时显著减少自发疼痛行为（P < 0.001）。

3.5 降低促炎细胞因子水平

ELISA检测显示，CFA模型小鼠患侧足爪、L4-L6脊髓及血清中TNF-α和IL-1β水平显著升高。14e处理组上述组织中两种细胞因子均被显著抑制（P < 0.01），证实其通过调控局部与系统性炎症发挥镇痛作用。

3.6 安全性评价

急性毒性试验中，500 mg/kg 14e灌胃处理KM小鼠14天后，体重增长、脏器指数（心、肝、脾、肺、肾）及血清ALT/AST水平均与溶剂对照组无显著差异，表明其具有良好的安全窗。

4 结论

本研究基于IDO1血红素活性中心结构特征，成功设计并合成具有1,2,3-三唑单元的苯并恶嗪酮衍生物。化合物14e通过三唑-铁离子配位、π-π堆积及氢键网络实现高效IDO1抑制，显著 alleviates CFA诱导的神经炎症与多模态疼痛行为，且安全性优异，为靶向色氨酸代谢通路的镇痛药物开发提供了先导化合物。

5 实验部分

生物学实验采用C57BL/6雄性小鼠，CFA模型通过左后足底注射40 μL完全弗氏佐剂建立。行为学测试包括机械刺激（0.07 g/0.4 g von Frey纤维）、热刺激（辐射热仪）及自发疼痛观测（10分钟内抬足/守护时间）。蛋白检测采用Western blot（Iba1、GAPDH抗体）及ELISA（TNF-α、IL-1β试剂盒）。分子对接以4PK6为模板，通过Schr?dinger软件完成。统计采用GraphPrism 7.0，数据以均值±SEM表示，P < 0.05为显著标准。