mTOR/RAB1A通路依赖的细胞外囊泡重塑前列腺癌骨转移前微环境的机制与治疗意义

本研究揭示前列腺癌（PCa）通过mTOR/RAB1A轴调控肿瘤源性细胞外囊泡（tEVs）分泌，介导骨髓B淋巴细胞-髓系细胞失衡和免疫抑制性骨转移前微环境（PMN）形成。靶向RAB1A可抑制tEVs分泌，逆转免疫抑制并延长生存期，为PCa骨转移提供了新的诊断生物标志物（PD-L1+ Breg）和治疗策略（GW4869）。

　　

Background:

骨转移是前列腺癌（PCa）患者最常见的转移部位，也是导致晚期患者预后不良的关键因素。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂的临床疗效有限，可能源于通路的复杂性。在肿瘤细胞定植之前，原发PCa细胞通过分泌包括细胞外囊泡（EVs）在内的介质主动重塑骨微环境。本研究旨在探讨EV生物发生的调控机制以及EVs对骨转移前微环境（PMN）的影响，为抗骨转移提供新的治疗策略。

Methods:

研究采用PCa细胞系（人源DU145和PC-3，鼠源RM-1），通过蛋白质印迹（WB）检测mTOR和Ras相关蛋白Rab-1A（RAB1A）的蛋白表达水平。功能实验（侵袭和增殖）用于验证RAB1A表达对生物学行为的影响。EVs的生物学特性通过WB、纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜进行表征。基于GSE143791单细胞数据集分析骨髓细胞亚群的变化。用EVs处理细胞和动物模型，评估其对骨髓微环境、生存时间和骨转移负荷的影响。最后，比较有无骨转移患者的外周血常规参数。

Results:

利用PCa细胞系，研究发现mTOR激活抑制致癌因子RAB1A的泛素化活性，从而稳定其表达。肿瘤来源的EVs通过B细胞功能障碍和髓系细胞扩增促进骨免疫抑制，凸显了其在PMN形成中的作用。在过表达RAB1A的PCa动物模型中，GW4869介导的EV分泌抑制延长了小鼠生存期，改善了骨髓异常，增强了B细胞活化能力，并减少了调节性B细胞（Breg）比例。

3.1 Inactivation of the mTOR signaling pathway accelerates RAB1A degradation via the ubiquitin-proteasome system

分析GSE77930数据集发现，骨转移肿瘤组织中的mTOR表达显著高于其他部位。GSE32269数据集显示，有骨转移的PCa患者肿瘤组织中的mTOR信号通路活性显著高于局限性PCa，且与RAB1A表达呈正相关（R = 0.4, P = 0.0033）。下调RAB1A表达并未改变S6K磷酸化状态，但mTOR抑制剂雷帕霉素处理降低了PCa细胞中的RAB1A蛋白水平。Co-IP实验表明mTOR与RAB1A存在物理相互作用。雷帕霉素和蛋白酶体抑制剂MG132共处理可恢复由雷帕霉素单独处理降低的RAB1A蛋白水平，且mTOR抑制剂进一步显著增加了RAB1A的泛素化。半衰期分析显示，未经雷帕霉素处理时，RAB1A蛋白在体外显著更稳定。机制上，mTOR信号通路以泛素依赖性方式调控RAB1A的翻译后修饰。

3.2 RAB1A expression is positively correlated with PCa progression

敲低RAB1A显著损害了两种PCa细胞系的增殖。一致地，沉默RAB1A导致PCa细胞迁移和侵袭能力显著降低，并抑制集落形成。此外，耗尽RAB1A导致更高比例的凋亡细胞。这些发现表明RAB1A敲低减弱了肿瘤发展，提示RAB1A可能作为抑制PCa发展的潜在治疗靶点。

3.3 RAB1A expression positively influences EV production

分析TCGA数据库数据显示，RAB1A与参与小GTP酶介导信号转导的多种基因相关。qRT-PCR分析显示，敲低RAB1A后，所选因子（如RAB27、RAB7、ALIX、RAB5、RAB11、SNAP23、RAB35）的mRNA表达显著下调。WB分析证实，在shRAB1A PCa细胞中，这些因子的蛋白表达不同程度降低。这些数据确立了RAB1A作为PCa中EV生物发生的关键调节因子，可能通过协同抑制必需的Rab GTP酶（RAB27A、RAB7A、RAB5A、RAB11A、RAB35）和EV货物分选/支架因子（ALIX、TSG101、SNAP23、CD9）来实现。

来自shRAB1A PCa细胞的EVs在相同浓度下表达较低水平的TSG101和Alix。TEM图像显示内陷和典型的杯状膜囊泡。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示颗粒分布范围在100–200 nm，与功能性EVs的直径一致。shRAB1A PCa细胞分泌的EVs更少且尺寸更小。这些发现共同证明RAB1A敲低显著破坏了PCa细胞中的EV生物发生和分泌。EV产量和颗粒大小的同时减少进一步表明RAB1A在调节EV数量和大小的特征中起重要作用。

3.4 B lymphocyte-myeloid cell ratio imbalance in the pre-metastatic bone microenvironment

基于GSE143791单细胞数据集，分析了接受髋关节置换手术患者（良性组）和远离肿瘤部位的不同椎体标本（远端组）的骨髓细胞测序数据。骨髓细胞亚群图谱显示B细胞群体减少和巨噬细胞增加。统计结果表明，远端组T细胞比例与良性组相比无显著差异，而祖B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞的比例均显著降低（P < 0.05）。相反，巨噬细胞和NK细胞的比例显著增加（P < 0.05）。此外，远端组红细胞比例显著增加（P < 0.05）。总之，在骨转移病变形成之前，骨髓微环境已经通过多种调控机制参与PMN构建，其特征是髓系细胞扩增和B淋巴细胞谱系发育受抑制。

3.5 EVs derived from PCa dysregulate the proportions of lymphocytes and myeloid cells

通过左心室（LCV）注射RM-1细胞建立骨转移小鼠模型。分析有骨转移的PCa小鼠骨髓细胞亚型显示总B细胞减少，CD11b⁺细胞增加，CD3⁺细胞无显著变化，表明骨髓细胞发育严重破坏。流式细胞术进一步表征了骨髓中所有主要B细胞亚群。

为了研究tEVs在骨髓细胞分化中的调节作用，用tEVs、热灭活tEVs（56°C加热10分钟以有效灭活生物活性分子）、条件培养基或与RM-1细胞共培养来处理骨髓细胞。体内外实验均显示，EVs处理的骨髓细胞中前祖B细胞（B220^lo+CD24⁺BP-1^-）频率增加，同时原B/前B细胞（B220⁺CD24⁺CD43^-IgM^-IgD^-）减少。这些改变与tEV浓度呈正相关，并且tEVs阻断前祖B细胞向原B/前B细胞的分化，这种作用可被热灭活减弱。用来自转导对照shRNA（shCtrl-EVs）或靶向RAB1A的shRNA（shRAB1A-EVs）的等量RM-1细胞的EVs处理骨髓细胞。与浓度依赖性一致，shRAB1A-EVs（产量较低）引起的B细胞群体变化不如shCtrl-EVs明显。

体外研究显示B淋巴细胞显著减少和CD11b⁺髓系细胞增加，这与体内观察一致。此外，tEV处理后存在显著数量的贴壁细胞，其中大多数是CD11b⁺F4/80⁺细胞。造血转录因子（TFs）分析显示，tEVs将骨髓细胞的转录谱重编程为髓系谱系，表现为PAX5（B细胞主调节因子）表达降低和髓系相关基因表达增加。总之，tEVs诱导骨髓细胞中的髓系偏向特征，这是由CD11b⁺细胞丰度增加和TF介导的转录重编程共同驱动的。

3.6 B cells transdifferentiate into myeloid cells under tEV-mediated induction

在PCa模型骨转移部位的多色IF染色显示，CD68⁺髓系细胞内存在一小群CD19⁺细胞，提示CD19⁺ B细胞与CD68⁺巨噬细胞之间存在潜在的相互作用。髓系和淋巴系起源于共同的多能祖细胞，并在分化过程中共享一组相似的基因。在某些情况下，对造血系统不断变化的需求的反应可能导致两系之间的转化。分选的骨髓细胞的单细胞轨迹分析证明了骨PMN内的B-髓系转分化。

随后，采用伪时序热图分析来识别关键的细胞状态转换点和协调阶段特异性分化的相关信号通路。

为了相对模拟PMN形成阶段tEVs产生的条件，通过尾静脉注射用PBS、热灭活tEVs或tEVs处理C57BL/6小鼠。首先，静脉注射PKH26标记的tEVs，4小时后通过流式细胞术分析骨髓细胞。tEVs处理的小鼠骨髓细胞显示髓系细胞显著富集和B淋巴细胞急剧减少。此外，tEVs在骨髓中诱导PD-L1⁺ Breg并显著抑制B细胞活化。相应地，在tEVs治疗组的外周血（PB）中，总B细胞显著减少，而髓系细胞增加，这反映了骨髓中观察到的趋势。同时，骨髓细胞和PB细胞中PD-L1⁺ Breg细胞比例增加，B细胞活化状态仍然受到抑制。此外，发现tEVs组血浆细胞因子谱呈现促肿瘤特征，如IL-6增加和IL-12p40、IL-12p70减少。tEVs处理导致体重增长较慢，尽管差异未达到统计学显著性。活性tEVs（而非热灭活tEVs）的全身给药在小鼠中重现了PMN形成。

用补充了tEVs的完全培养基培养MACS纯化的CD19⁺ B细胞（纯度 > 95%）。EV暴露诱导CD19⁺ B细胞显著的形态学改变，表现为细胞大小增加（通过FSC-A量化）。体内外实验均显示，tEVs处理组中B220⁺CD11b^-细胞的比例和绝对细胞数量均增加。接下来，对用PBS或tEVs处理的CD19⁺ B细胞进行转录组测序。在tEVs处理的CD19⁺细胞中，观察到与M2巨噬细胞（Arginase-1、Myc和CD163）和趋化因子相关的基因表达增加。GO分析显示，tEVs抑制了免疫球蛋白产生、B细胞活化、适应性免疫反应、免疫细胞增殖等过程的活性。总之，这些发现证明tEVs驱动B细胞转分化为髓系谱系，这有助于PMN形成中B淋巴细胞和髓系细胞之间的失衡。

3.7 PCa-derived EVs promote bone metastasis in vivo

接下来，研究了tEV处理对PCa模型小鼠生存结果的影响。鉴于心内PCa模型未能充分重现原发性肿瘤中发生的早期转移事件，用tEVs预处理野生型小鼠。正如预期，tEVs预处理的PCa小鼠表现出生存期缩短和骨转移负荷增加。定量分析显示，tEVs处理的PCa小鼠骨髓中CD11b⁺髓系细胞频率显著增加，同时B淋巴细胞群体减少。此外，荷瘤小鼠表现出脾肿大，而无瘤对照小鼠则没有。

为了阐明RAB1A在癌症免疫编辑的免疫调节中的潜在贡献，使用RAB1A过表达质粒和GW4869（一种外泌体生物发生抑制剂）建立实验模型。GW4869显著恢复了RAB1A诱导的髓系细胞和B细胞之间的失衡。同时，观察到骨髓中PD-L1⁺ Breg比例增加和B细胞活化抑制。这些结果表明，RAB1A通过增强EV分泌促进PCa进展，而抑制EV分泌可恢复骨髓微环境并抑制肿瘤进展。

临床上，PB分析显示，与无转移的PCa患者相比，有骨转移的PCa患者淋巴细胞比例显著降低（P = 0.042），但单核细胞频率未变。总之，这些发现确立了RAB1A-EV分泌轴是骨转移微环境形成的主要调节因子，通过髓系扩增和B细胞功能障碍驱动免疫抑制，而其治疗性阻断提供了破坏PCa进展恶性循环的多方面策略。

4 Discussion

在骨转移发展的早期阶段，tEVs被释放到血液循环中并运输到骨骼，在那里它们通过多方面的分子机制协调免疫抑制性和炎症性PMN微环境。自该发现以来，广泛的研究集中于表征转移前微环境的形成，主要由调节性免疫细胞启动。例如，黑色素瘤教育的骨髓祖细胞来源的外泌体促进促转移表型。值得注意的是，我们先前的工作揭示了一种新机制，即食管癌来源的EVs破坏循环滤泡辅助性T细胞和循环滤泡调节性T细胞之间的平衡，从而促进免疫逃逸和肿瘤进展。因此，tEVs是否可以通过B细胞间接调节其他免疫细胞的功能尚不确定，这在理解PMN形成过程中tEVs-B细胞串扰方面存在巨大的知识空白。

本研究证实，与其他转移的PCa患者相比，有骨转移的PCa患者mTOR表达升高。研究发现，mTOR信号通路失活导致RAB1A表达减少，这可能解释了mTOR抑制剂在PCa治疗中临床疗效有限的原因。此外，mTOR信号通路的激活上调了RAB1A表达，从而促进EV释放。注射tEVs的小鼠表现出B淋巴群体显著减少和髓系区室扩增，反映了在人类患者远离肿瘤部位的椎体骨微环境中发现的免疫细胞模式。这些发现确立了tEVs作为转移进展中骨髓免疫调节的直接介质。

在骨髓中，B细胞前体和未成熟IgM⁺ B细胞保留可塑性和髓系转分化的潜力。此外，tEVs通过髓系分化和破坏淋巴偏向的HSC发育驱动骨髓重建。尽管结果证明tEVs可在体内外诱导B细胞转分化为髓系细胞，但它们也揭示了骨转移早期阶段细胞的异质性和可塑性的变化。然而，tEVs中导致淋巴生成和髓系生成失调的具体因素尚不清楚。据报道，EVs中TGF-β和miR-21的富集为功能验证提供了候选介质。进一步的研究应采用EV亚型分馏和基于CRISPR的货物编辑来确定因果关系。这些发现确立了tEVs作为转移进展中骨髓免疫调节的直接介质。

总之，本研究描绘了一条新的mTOR/RAB1A调节的EV分泌轴，该轴协调PCa骨转移。EVs通过B淋巴细胞抑制和髓系偏斜驱动免疫抑制微环境形成。体内实验结果强调了tEVs在PCa骨转移进展中的重要作用。此外，RAB1A作为一个新靶点，具有在临床实践中逆转免疫抑制和增强免疫治疗反应的潜力。mTOR抑制剂在PCa中的有限疗效可能反映了补偿性EV介导的串扰，提示共同靶向RAB1A和PD-1/PD-L1可以克服微环境免疫抑制。考虑到原发性肿瘤通过释放因子破坏骨髓细胞活动，PB中的细胞亚群可能作为检测骨转移和监测抗骨吸收治疗反应的潜在生物标志物。将进一步纳入骨髓-外周B细胞动力学的前瞻性相关性分析，以量化比例变化和亚型改变，同时结合纵向PCa队列中骨转移的临床证据。