土壤病毒驱动亚热带次生林演替过程中的碳周转：从群落动态到功能代谢的生态机制

《Frontiers in Microbiology》：Soil viruses drive carbon turnover during subtropical secondary forest succession

本研究系统揭示了亚热带次生林演替过程中土壤病毒群落的动态变化及其对碳循环的调控作用。通过病毒宏基因组学与生态模型分析，发现病毒丰度随林龄增加而上升，其多样性受细菌多样性和土壤pH驱动。功能注释显示病毒携带大量碳水化合物代谢基因（CAZymes），介导了从碳固定到碳释放的功能演替，表明病毒通过调控宿主代谢过程深刻影响森林土壤碳周转。

　　

1 引言

森林生态系统作为全球陆地生态系统中最大的碳库和最有效的碳汇，储存了全球约45%的土壤碳。亚热带森林因其独特的地理气候条件，成为全球生物多样性的热点区域，其能量流动和物质循环对全球元素生物地球化学循环具有重要意义。土壤微生物群落在养分循环、植物生长和生态系统多功能性中发挥关键作用，而病毒作为土壤微生物群落的重要组成部分，虽然数量丰富，但相较于细菌和真菌的研究仍显不足。

病毒是地球上最丰富的生物实体，也是全球生物地球化学循环的关键驱动者。在土壤生态系统中，病毒通过两个核心功能发挥关键生态作用：调控宿主种群动态和推动生物地球化学循环。具体机制包括通过水平基因转移驱动宿主进化，以及获取宿主来源的辅助代谢基因（AMGs）并表达这些基因，从而参与宿主的代谢和生命过程，包括光合作用、碳氮硫代谢、核酸合成与代谢以及磷酸盐代谢等，最终改变生态系统生产力和影响生物地球化学循环。

近年来，随着土壤病毒研究的热度上升，其对碳循环的影响开始受到广泛关注。研究表明，病毒通过自上而下和自下而上的调控方式影响元素循环：一方面通过编码AMGs直接控制元素循环；另一方面通过感染和裂解宿主微生物间接影响元素的生物地球化学循环。病毒穿梭机制表明，土壤病毒可以增加难降解溶解有机质（DOM）的丰度，这些DOM对微生物具有相对较高的生物可利用性，是微生物代谢的重要底物。此外，"病毒分流"模型指出，病毒裂解宿主细胞释放的物质可以为土壤生境中其他微生物种群的生长提供底物，从而通过裂解将碳从宿主转移至土壤有机碳库，增强土壤碳汇。研究还显示，土壤病毒诱导的裂解显著增加可溶性碳含量，促进有机碳周转，调节CO₂排放，同时提高微生物碳利用效率，加速微生物群落周转，从而增强森林土壤的碳汇功能。

2 材料与方法

2.1 研究区域概况与样品采集

研究区域位于福建省龙岩市上杭县白沙国有林场，属于亚热带季风气候区，年平均气温20.1℃，年降水量1600毫米。2018年6月，从该地区次生林采集土壤样品，设置了5个林龄梯度：8年（幼龄林）、20年（中龄林）、27年（近熟林）、40年（成熟林）和100年（过熟林），每个梯度3个重复，共15个土壤样品。每个样品选择3个采样点，采用五点采样法收集表层土壤（0-10厘米），立即用冰盒运送至实验室，过2毫米筛后分装保存于4℃和-80℃备用。

2.2 土壤理化性质测量

土壤理化性质测量参考《土壤农化分析》方法，包括铵态氮（NH₄⁺-N）、硝态氮（NO₃^?-N）、溶解有机碳（DOC）、溶解有机氮（DON）、总碳（TC）、总氮（TN）、有效磷（AP）、电导率（EC）、土壤含水量（SWC）和土壤pH。

2.3 土壤病毒和微生物荧光显微镜定量

实验参照Trubl等人和Xiao等人的方案并针对现场土壤条件进行修改。关键步骤包括：3克新鲜土壤与10毫升AKC缓冲液混合，振荡孵育15分钟后收集上清液，重复提取三次。提取液经0.45μm过滤器过滤后，通过真空过滤系统加载到0.02μm Anodisc Al₂O₃滤膜上，暗干后添加SYBR Green I溶液染色20分钟，最后在荧光显微镜下观察计数。

2.4 总DNA提取和扩增子测序

使用FastDNA Spin Kit for Soil提取土壤样品总微生物DNA，对16S rRNA基因V4区进行PCR扩增，引物为515F/806R。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，切胶纯化并使用TruSeq DNA Sample Prep Kit构建测序文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。

2.5 病毒DNA提取和宏基因组测序

病毒DNA提取过程 adapted from Han等人用于农业土壤的方法并适当修改：50克新鲜土壤与150毫升AKC缓冲液混合，振荡孵育后离心收集上清液，重复提取三次。上清液使用切向流过滤系统依次通过0.6μm、0.45μm和0.22μm中空纤维滤柱和30kDa超滤柱浓缩，最后使用Power Viral Environmental RNA/DNA Isolation Kit提取病毒DNA。DNA经Covaris M220超声破碎后，使用Accel-NGS 1S Plus DNA Library Kit构建文库，在Illumina HiSeq 2500平台上进行高通量测序。

2.6 病毒组数据处理

使用Fastp软件对原始数据进行质量修剪，获得clean reads后使用metaSPAdes软件将clean reads组装成contigs。clean reads通过Blastx与病毒数据库进行比较（E值<1e-5）获得物种分类注释。病毒数据库整合了NCBI非冗余（NR）数据库、Refseq病毒数据库和PHAST网站的噬菌体数据库。使用Prodigal v2.6.3预测开放阅读框（ORF），预测的蛋白质序列与KEGG蛋白质数据库进行比较（E值<1e-5），并使用MEGAN 6进行病毒功能分类。使用dbCAN meta服务器在线工具对病毒contigs进行CAZyme辅助代谢基因注释。

2.7 统计分析

使用SPSS进行统计分析，包括单因素方差分析（ANOVA）和方差齐性检验。使用Origin软件绘制丰度条形图，使用R v4.4.1作为主要绘图工具创建相关性热图和随机森林模型，探索病毒和微生物丰度的环境驱动因素。

3 结果

3.1 森林演替过程中土壤理化性质

不同演替阶段次生林土壤pH呈酸性，且呈现先升高后降低的趋势。随着林龄增加，SWC、NH₄⁺-N、NO₃^?-N、TN和TC出现显著差异。SWC持续增加，40年和100年次生林土壤含水量显著高于其他林分。NH₄⁺-N和NO₃^?-N在40年次生林土壤中呈现相反趋势，NH₄⁺-N含量最高而NO₃^?-N含量最低。TN和TC含量显著增加，在100年次生林土壤中达到最大值。

3.2 病毒丰度及环境驱动因素

通过荧光显微镜直接计数土壤中病毒和微生物的丰度。病毒样颗粒（VLPs）丰度范围在8.58×10⁹ gdw^?1至1.63×10¹⁰ gdw^?1之间，微生物丰度范围在1.56×10⁹ gdw^?1至4.18×10⁹ gdw^?1之间。土壤病毒与微生物比率（VMR）范围在4.0至7.2之间。随着林龄增加，土壤VLP丰度和微生物丰度均逐渐增加，在100年次生林土壤中达到最大值。20年次生林的VMR显著高于其他林分。结合两图可见，随着微生物丰度增加，VMR降低。

Pearson相关性分析显示，VLP丰度与微生物丰度呈显著正相关，VMR与微生物丰度呈显著负相关。林龄与VLP丰度、微生物丰度、TC和TN呈显著正相关，而与VMR呈负相关。随机森林模型表明，微生物丰度是影响病毒丰度和VMR的最重要因素，而VMR和病毒丰度是影响微生物丰度的主要因素。林龄的重要性仅次于这三个生物因素，且发挥显著作用。

3.3 病毒和细菌群落多样性

从土壤样品的病毒宏基因组数据中共鉴定出30个病毒目、61个病毒科和671个病毒属。研究发现病毒群落主要由有尾噬菌体组成，感染细菌，占群落的55.77%。在科水平上，Siphoviridae的平均相对丰度最高，其次是Microviridae、Podoviridae和Myoviridae。细菌注释结果显示，在15个次生林土壤样品中，细菌跨越20个细菌门，包括变形菌门、浮霉菌门、酸杆菌门等。其中变形菌门占主导地位，占总细菌种群的31.13%，其次是浮霉菌门、酸杆菌门和放线菌门。

在次生林演替过程中，病毒群落的组成比例发生显著变化，100年林分代表一个显著的转折点。Myoviridae、Siphoviridae、Mimiviridae和Phycodnaviridae呈波动增加趋势，在100年土壤中达到最高相对丰度。相反，Podoviridae和Microviridae呈现相反趋势，在100年土壤中显示出最低相对丰度。Microviridae在40年土壤中显著增加，但在100年土壤中急剧下降。细菌群落组成在不同林龄间相对丰度略有波动，但优势细菌门未发生剧烈变化，表明土壤微生物可能具有一定的生态稳定性。不同林龄土壤间病毒群落多样性无显著差异，而细菌群落均匀度显示显著差异，表明林龄可能影响细菌群落均匀度和分布格局，特别是在较高林龄时。

结构方程模型（SEM）表明，土壤养分对细菌多样性有显著负效应，而土壤理化性质和细菌多样性对病毒多样性有显著正效应。具体而言，细菌多样性和土壤理化性质直接影响病毒多样性，而土壤养分通过影响细菌多样性间接影响病毒多样性。混合线性模型显示，细菌群落多样性、土壤pH和NH₄⁺-N对病毒多样性均有高度显著正影响，可溶性有机碳和有机氮的影响稍小。其中细菌群落多样性贡献最大，其次是土壤pH，土壤养分的贡献相对较小。

中性群落模型表明，病毒和细菌群落构建主要受中性过程（即扩散-漂变平衡）驱动。然而，细菌群落的环境选择作用比病毒群落更强。同时，两个群落都具有高迁移率，病毒的迁移率显著高于细菌。

3.4 病毒介导的碳循环潜力及环境驱动因素

将获得的KO编号与KEGG Orthology数据库进行比较，对次生林土壤病毒组的功能注释进行分类。在Level 1水平，注释了六种病毒功能，其中代谢功能占比最大，为67.1%，而与人类疾病相关的功能占比最小，仅为1.04%。在Level 2水平，对代谢功能基因的进一步分析显示，碳水化合物代谢基因的相对丰度最高。氨基酸代谢、能量代谢以及辅因子和维生素代谢基因也占相当大比例。使用丰度热图进行聚类分析显示，随着林龄增加，丰度最高的碳水化合物代谢基因的相对丰度也增加。

冗余分析（RDA）显示，环境因素共同解释了土壤病毒功能谱总变异的50.37%。不同林龄间病毒功能存在显著差异，病毒群落功能的变化与土壤pH显著相关。

基于KO丰度的功能注释和使用DiTing软件的代谢途径重建推断，土壤病毒组在碳循环途径中的功能潜力可能在次生林不同演替阶段存在显著差异。在幼龄林中，病毒功能基因主要富集在碳固定途径，特别是CBB循环和Wood-Ljungdahl（WL）途径，这可能表明病毒通过调控自养微生物参与碳固定过程。随着林龄增加，中龄林病毒组的功能逐渐转向呼吸和分解相关代谢途径，表明异养过程增强。在近熟林阶段，病毒相关基因显著富集在还原性TCA循环（rTCA）中，表明该阶段的宿主可能具有更强的碳固定潜力。在成熟林和过熟林中，病毒功能潜力更集中于乙酸代谢和碳释放相关途径，这可能表明土壤病毒群落通过宿主调控机制促进有机物分解和碳释放。

为了进一步阐明病毒在土壤碳循环中的作用，使用dbCAN服务器基于3,278个vOTUs的CAZymes特征结构域鉴定进行碳水化合物活性酶（CAZymes）注释。结果显示，次生林土壤中存在46种病毒CAZymes，分为糖苷水解酶（GH）和糖基转移酶（GT），其中GH24和GT4占比最高。8年次生林土壤中未检测到辅助碳水化合物代谢基因，而27年土壤中检测到的代谢基因最多。GT2和GH104基因仅在40年土壤中发现。代谢基因数量随着林龄增加呈现先增加后减少的趋势。根据相对丰度图，最丰富的基因随着林龄增加而变化。在20年和40年土壤中，GH24是最丰富的基因，而GT4在27年土壤中占主导地位。在100年土壤中，GH19占比最高。

4 讨论

4.1 亚热带次生林土壤病毒群落和功能的主要驱动因素

先前研究表明，土壤中病毒的丰度受多种因素影响，包括土壤类型、理化性质和其他环境条件。相关性分析和随机森林模型揭示，土壤病毒丰度与林龄、宿主微生物丰度、TN和TC呈高度显著正相关，表明林龄是驱动土壤病毒丰度变化的关键环境因素。微生物丰度是影响土壤病毒丰度的关键生物因素，而TN和TC是影响土壤病毒丰度的必需理化因素。

结构方程模型表明，细菌多样性对病毒多样性有直接正向影响，其次是土壤理化性质，而土壤养分通过影响细菌多样性间接影响病毒多样性。混合线性模型和结构方程模型相互验证了这一发现，揭示细菌群落多样性显著影响病毒群落多样性，土壤pH的影响次之，土壤养分的贡献相对较小。对大豆根际微生物组的研究表明，病毒群落的动态多样性与宿主细菌的演替密切相关。在开花期，病毒的宿主范围扩大并感染特定功能群，表明宿主多样性驱动病毒感染特异性和功能分化。本研究发现宿主微生物的丰度是影响土壤病毒丰度的关键生物因素，进一步证实了土壤细菌对病毒群落的显著影响。与大量先前研究一致，本研究中土壤pH也被确定为影响病毒群落多样性的关键环境因素。病毒在固体表面的吸附是一种常见现象，这一过程与土壤颗粒表面的静电特性密切相关，而静电特性很大程度上受土壤pH调控。对农业红壤的研究表明，土壤pH可以影响病毒在土壤颗粒上的吸附，随着土壤pH升高，病毒吸附减少，从而影响病毒繁殖，表明pH通过影响病毒吸附直接影响病毒多样性。此外，本研究确定pH是影响病毒功能潜力的主要环境因素。这一方面可能是因为pH在调节宿主生长和代谢中起关键作用，从而间接影响病毒功能；另一方面，pH波动可能直接影响AMGs的表达和功能。研究表明，土壤pH调节病毒群落组成，从而调控病毒携带AMGs的能力。不同的病毒组合携带差异化的AMG库，伴随功能表达的变异。

4.2 时间演替对亚热带次生林土壤病毒群落的影响

本研究中，次生林土壤中的病毒丰度随着林龄增加而增加，并在100年土壤样品中达到最大值。此外，宿主微生物的丰度以及TN和TC含量也在100年森林土壤中达到峰值。林龄对病毒群落的积极影响可能归因于较老森林土壤中较高水平的碳和氮养分，如理化分析所示。这些富集条件可能支持更丰富和多样化的宿主微生物群落，从而为病毒复制提供有利环境并增加感染机会。

基于病毒物种注释结果，次生林土壤中的优势病毒群是有尾噬菌体，其中Siphoviridae的平均相对丰度最高，与先前研究一致。在次生林发展过程中，各种病毒群落的相对丰度发生显著变化，Myoviridae、Siphoviridae、Mimiviridae和Phycodnaviridae波动增加，而Podoviridae和Microviridae波动减少，分别在100年森林土壤中达到最高和最低相对丰度。同时，Microviridae在40年森林土壤中显著增加，但在100年土壤中急剧下降。然而，不同林龄土壤间病毒群落的丰富度和均匀度差异不显著，这可能是因为在宿主密度高的次生林中，溶原性噬菌体倾向于整合到宿主基因组中，从而减少群落波动。这一现象与经典的"搭便车获胜者"（PtW）模型一致。根据PtW模型，在高宿主密度下，噬菌体倾向于采用溶原循环，整合到宿主基因组中，病毒与宿主比率受到抑制。本研究中，亚热带次生林中微生物丰度越高，VMR越低，表明病毒分布遵循PtW模型。中性群落模型也表明，次生林土壤中病毒群落的分布主要受中性过程（扩散-漂变平衡）支配，高迁移率和中等拟合优度共同支持不同林龄间病毒群落丰富度和均匀度无显著差异的现象。

4.3 土壤病毒对亚热带次生林碳循环的潜在影响

相关研究表明，病毒可以通过其编码的辅助代谢基因以向上调控的方式间接调节宿主群落生命过程，从而影响土壤碳循环。本实验中，KEGG功能注释预测，在不同林龄的亚热带次生林土壤病毒组中，存在大量与碳水化合物代谢相关的功能基因。这些基因帮助宿主分解和利用复杂碳水化合物，从而增强病毒和宿主的环境适应性。这表明病毒感染宿主微生物后，可能通过碳代谢相关基因的表达影响宿主微生物，间接参与森林土壤碳循环过程。随后对土壤病毒组碳循环途径的预测揭示，不同林龄土壤病毒的功能潜力呈现明显的演替变化，反映了从碳固定到有机物分解再到碳释放的生态功能转变。这表明病毒在森林演替过程中发挥动态功能作用，其携带的代谢功能基因可能影响宿主微生物对碳的固定、转化和释放，从而影响森林土壤碳循环。

因此，为了进一步分析辅助代谢基因在土壤病毒碳循环中的潜在作用，我们对土壤病毒组基因组中的CAZymes进行了注释。结果证实亚热带次生林土壤病毒组中存在丰富多样的CAZymes，其中大部分是GH，较小部分是GT。GH酶可以促进复杂碳水化合物的降解，从而增加能量产生和增强宿主代谢，而GT酶催化活化糖与生物体内各种受体分子的连接，这与碳水化合物的合成和转移有关。

基于碳代谢途径分析和CAZymes注释的整合，观察到一个协调模式，共同突出了土壤病毒在亚热带次生林碳循环过程中的潜在作用。在演替早期，森林土壤主要以碳固定和储存为特征，微生物分解活动相对较弱；相应地，在病毒宏基因组中未检测到CAZyme基因。在演替中期，碳分解和呼吸作用变得更加突出，属于糖苷水解酶（GH）和糖基转移酶（GT）家族的CAZyme基因开始积累，表明病毒可能调节宿主碳代谢，特别是在碳源降解和转化方面。演替中后期似乎是土壤碳循环的关键阶段，在此期间病毒功能转向更平衡的碳同化和释放谱。此阶段GH和GT基因丰度的增加表明病毒不仅参与碳固定，还积极促进碳底物的分解和周转。在成熟林阶段，病毒功能潜力进一步转向碳动员和释放。在此期间有机物降解和碳释放达到峰值，GH和GT基因丰度保持高位。这表明病毒可能通过调节宿主代谢过程促进碳水化合物降解、糖基转移和再合成，从而积极促进碳循环。尽管在老熟林阶段生态系统老化和碳 sequestration 能力降低，但仍需要分解大量有机物。微生物活动继续加速碳释放，病毒CAZyme基因保持中等丰度，促进碳返回大气。总的来说，这些发现表明土壤病毒在亚热带次生林土壤不同演替阶段的碳循环调节中扮演潜在重要且动态的角色。

5 结论

我们的研究提供了实验证据表明亚热带次生林土壤病毒群落在不同林龄间表现出 distinct 分布模式。病毒丰度随着林龄增加而逐步增加，病毒群落的分布符合"搭便车获胜者"（PtW）模型。细菌多样性和土壤pH被确定为塑造病毒群落多样性的关键驱动因素。此外，本研究证实了土壤病毒可能参与森林发展过程中的碳循环。功能潜力分析揭示了从碳同化向碳释放的演替转变，突出了病毒在介导土壤碳周转中的动态生态作用。然而，本研究未涉及病毒功能基因的转录验证。未来研究应整合RT-qPCR或病毒宏转录组学，以进一步阐明病毒代谢基因如何表达并在关键碳循环途径中功能参与。总体而言，这项研究为亚热带森林演替过程中土壤病毒的分布动态提供了时间洞察，扩展了我们对次生林发展、土壤病毒生态学和碳循环过程之间相互作用的理解。