一锅法溶胶-凝胶合成锶/钙掺杂二氧化硅纳米颗粒用于骨质疏松症的成骨治疗：尺寸调控与抗氧化协同机制

本综述系统探讨了通过溶剂调控（水相vs.乙醇/水混合相）的一锅法改性St?ber合成策略，制备具有不同尺寸（74±5 nm vs. 224±42 nm）和形态（球形vs.类核壳结构）的锶/钙掺杂介孔生物活性玻璃纳米颗粒（BGNPs）。研究证实，乙醇的引入可细化颗粒尺寸、提升均匀性，而两种BGNPs均能在非毒性浓度（0.1 μg/mL）下有效促进成骨分化（如碱性磷酸酶ALP活性上调），并展现显著的抗氧化活性（清除TBHP诱导的自由基）。该工作为开发兼具成骨诱导与氧化应激缓解功能的新型骨质疏松治疗平台提供了重要实验依据与材料设计策略。

　　

引言

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构退化为特征的全球性健康问题，影响超过2亿人，平均每3秒就发生一例骨质疏松性骨折。随着人口老龄化，其患病率持续上升，但诊断和治疗仍显不足。病理上，骨质疏松源于骨重塑失衡：破骨细胞吸收超过成骨细胞基质沉积，导致骨组织孔隙率增加、力学性能下降。绝经后女性尤为易感，因雌激素水平下降解除了对破骨细胞的抑制，并同时降低成骨细胞活性，加速骨丢失。流行病学数据显示，约40%的绝经后女性会发展为骨质疏松。

当前治疗主要依赖抗吸收药物（如双膦酸盐）和合成代谢剂（如重组人甲状旁腺激素rhPTH 1-34）。然而，双膦酸盐长期使用可能导致骨重塑过度抑制、非典型骨折和颌骨坏死；而系统性给予rhPTH或雌激素虽能上调成骨标志物（如RUNX2、ALP、OPN、OCN、BMP2、I型胶原），但存在显著副作用风险。因此，开发能够实现局部持续释放成骨刺激、同时最小化全身毒性的靶向递送系统备受关注。

生物活性玻璃（Bioactive Glasses, BGs）因其可降解性和成骨特性被广泛研究于组织工程和药物递送领域。其生物活性源于降解过程中释放的离子（如Si⁴⁺、Ca²⁺）能促进骨组织结合和成骨信号传导。近年来，研究焦点转向生物活性玻璃纳米颗粒（BGNPs），其高比表面积和表面体积比增强了生物活性和药物负载能力。特别是介孔结构的BGNPs，可通过掺杂不同阳离子（如Sr²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺）赋予多样化功能，包括促进成骨、血管生成、抗炎和抗菌。

其中，锶（Sr²⁺）和钙（Ca²⁺）是骨质疏松治疗中最常使用的掺杂离子。由于与Ca²⁺结构相似，Sr²⁺可替代钙进入骨矿物相，同时上调成骨标志物（ALP、RUNX2、OCN）并抑制破骨细胞活性。Sr²⁺的体内疗效呈剂量依赖性：低浓度（2–6 μg/mL）支持成骨分化和骨形成，而高浓度则产生 detrimental effects。Ca²⁺则在骨再生中关键促进羟基磷灰石（HA）沉积、调节成骨活性和刺激血管生成。

改性溶胶-凝胶（St?ber）法因其近环境温度操作、允许热敏感离子均匀掺入、且可制备具有高比表面积和可调介孔性质的纳米颗粒而备受青睐。溶剂组成（如乙醇/水比例）显著影响纳米颗粒形成：乙醇降低溶剂混合物的介电常数和极性，减缓硅烷前体（如TEOS）的水解速率，使缩合更可控、均匀，通常产生更小、更单分散的颗粒。此外，乙醇虽略微降低钙和锶硝酸盐的溶解度，但能调节硅网络形成，使Ca²⁺和Sr²⁺离子均匀整合到非晶基质中而不诱导结晶。

本研究聚焦于采用一锅法改性St?ber工艺合成掺杂Sr²⁺和Ca²⁺离子的球形和类核壳BGNPs，探讨不同溶剂（纯水vs.乙醇/水混合物）对纳米颗粒尺寸、形态及离子在硅网络中行为的影响，并评估其对于前成骨细胞MC3T3-E1的生物活性和清除活性氧（ROS）的能力。

材料与方法

材料

实验使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、氢氧化钠（NaOH）、叔丁基过氧化氢（TBHP）、硝酸锶（Sr(NO₃)₂）、硝酸钙（Ca(NO₃)₂）、二甲亚砜（DMSO）、氨水（NH₄OH）、正硅酸乙酯（TEOS）、乙醇（EtOH）和蒸馏水等试剂，均直接使用无需进一步纯化。细胞实验采用Minimum Essential Medium（α-MEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素、MTT assay试剂盒，以及小鼠前成骨细胞MC3T3-E1。

合成

通过一锅法改性St?ber方法合成两种不同形态的BGNPs：使用乙醇/水混合溶剂（0.3:1 M比）产生球形颗粒（SP-BGNPs），而纯水溶剂产生类核壳颗粒（CS-BGNPs）。具体步骤包括将CTAB、Ca(NO₃)₂、Sr(NO₃)₂和NH₄OH溶解于溶剂中，加入TEOS，室温搅拌过夜。随后通过离心清洗颗粒，并在550°C煅烧6小时。最终产物经研磨储存以备表征。

表征技术

采用透射电子显微镜（TEM）分析颗粒形貌和尺寸，动态光散射（DLS）测定流体力学直径和Zeta电位，SAXS/WAXS评估纳米结构和结晶性，BET法测量比表面积、孔体积和孔径分布，²⁹Si MAS NMR和¹H MAS NMR分析硅网络结构和氢物种，X射线光电子能谱（XPS）表征表面化学组成。

体外细胞毒性 assay

MC3T3-E1细胞以5×10⁴ cells/mL密度接种于96孔板，培养24小时后暴露于不同浓度（0–1000 μg/mL）的BGNPs 24、48和72小时，通过MTT assay检测细胞活力。

成骨分化评估

通过测量碱性磷酸酶（ALP）活性评估成骨分化。细胞以两种方式处理：直接与0.1 μg/mL BGNPs共培养24小时后更换新鲜培养基继续培养至7、14、21天；或使用BGNPs预孵育24小时后的离子释放上清液处理细胞。以含抗坏血酸、地塞米松和β-甘油磷酸的成骨培养基作为阳性对照。

自由基清除能力评估

采用DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit评估抗氧化活性。细胞加载DCFDA后，暴露于50 μM TBHP诱导氧化应激，然后加入含BGNPs（0.1 μg/mL）的成骨因子培养基培养24小时，测量荧光强度（λ_ex 495 nm, λ_em 529 nm）。荧光降低表明纳米颗粒自由基清除能力增强。

统计 analysis

所有体外实验结果以mean ± SD表示，基于三次独立重复（n=3）。多组比较采用单因素ANOVA与Tukey’s post hoc检验，两两比较采用Student’s t检验。

结果与讨论

CS-BGNPs与SP-BGNPs的合成与表征

TEM分析显示，SP-BGNPs（乙醇/水合成）呈球形，平均直径74±5 nm，易聚集；CS-BGNPs（纯水合成）为类核壳结构，平均直径224±42 nm。DLS测得的流体力学直径分别为91.8±5.8 nm（SP-BGNPs）和227.6±17.5 nm（CS-BGNPs），Zeta电位分别为-18.5±3.3 mV和-12.7±3.9 mV。PDI值（0.2 for SP-BGNPs, 0.4 for CS-BGNPs）表明SP-BGNPs尺寸分布更均一。尽管形态差异显著，ICP-OES显示两者元素组成（Ca、Si、Sr mol%）相近，表明溶剂选择不影响化学组成。

WAXS分析显示，两种BGNPs均以非晶硅相为主（宽峰15–30° 2θ），但存在微弱结晶相，经Rietveld精修鉴定为aragonic（CaCO₃）和strontianite（SrCO₃）。结晶相占比低于15%，且晶格参数略有位移，归因于Sr²⁺替代Ca²⁺引起的晶格应变。这些生物相容性结晶相可刺激成骨分化并抑制骨吸收。

SAXS图谱在双对数坐标中呈 approximately -2斜率，提示表面分形特征。CS-BGNPs表现出更高内部密度和更大尺寸，与DLS和TEM一致。BET分析显示，CS-BGNPs具有IV(a)型等温线和H4滞回环，比表面积（202.82 m²/g）、孔体积（0.38 cm³/g）和平均孔径（3.79 nm）均显著高于SP-BGNPs（10.46 m²/g, 0.03 cm³/g, 1.69 nm）。这表明水相合成有利于形成高表面积和多孔结构，而乙醇/水混合相产生更致密颗粒。

硅网络结构演化与氢物种化学组成

²⁹Si MAS NMR显示，两种BGNPs主要含Q³（δ_iso ~ -101 ppm）和Q⁴（δ_iso ~ -111 ppm）物种，少量Q²（~ -93 ppm），无Q¹，表明高度缩合的网络。SP-BGNPs的Q⁴比例更高（Q³/Q⁴比更低），缩合度（D_c=89.4）和网络连接性（NC=3.6）略高于CS-BGNPs（D_c=86.6, NC=3.5）。CS-BGNPs的非桥氧（NBO）分数更高，提示更多Ca²⁺/Sr²⁺作为网络修饰剂留在玻璃网络中，而SP-BGNPs中部分离子析出为碳酸盐晶体，使硅网络更缩合。¹H MAS NMR显示两者氢物种相似，主要为氢键合和移动水，孤立硅醇基<2%，溶剂选择不影响氢 speciation。

XPS survey谱仅显示Si、O、Ca、Sr和微量 adventitious carbon，确认无外来元素。高分辨谱中，Ca 2p_3/2（~347 eV）和Sr 3d_5/2（~134 eV）结合能略高于碳酸盐，典型于Ca–O–Si和Sr–O–Si linkages。O 1s主峰为Si–O–Si（~533 eV），C 1s中289 eV峰确认碳酸盐物种存在。Si 2p（103.4 eV）与氧化硅一致。原子比分析显示Sr/Si比相近，但SP-BGNPs的Ca/Si比（9.5:90.5）略高于CS-BGNPs（8.6:91.4），与ICP-OES和NMR结果一致。总体，溶剂切换未改变Ca/Sr掺入硅网络的方式。

细胞毒性 of BGNPs

MTT assay显示，处理72小时后，CS-BGNPs在浓度>0.1 μg/mL时显著降低细胞代谢活性，而SP-BGNPs在浓度高达10 μg/mL时仍无统计学显著毒性。这归因于尺寸依赖的毒性：大颗粒（CS-BGNPs）比小颗粒（SP-BGNPs）更易减少细胞活力。浓度≤0.1 μg/mL时，两种BGNPs均保持细胞活力>70%，因此后续ALP和ROS实验采用0.1 μg/mL。

BGNPs的成骨激活与自由基清除能力评估

ALP活性检测表明，经BGNPs离子释放上清液（ dissolution condition）处理的细胞，在21天时ALP活性显著高于基础培养基对照组（p<0.05），并与成骨培养基对照组相当；而直接与颗粒共培养（ particle condition）仅引起 modest increase。这表明Ca²⁺/Sr²⁺离子的持续释放是促进成骨分化的主要因素，完整纳米颗粒在显著溶解前作用较小。

自由基清除实验显示，添加TBHP后所有培养基的相对荧光单位（RFU）均增加，表明氧化环境成功建立。基础培养基+TBHP的RFU显著高于成骨培养基、SP-BGNPs和CS-BGNPs+TBHP组（p<0.05），而后三组间无统计差异。这表明BGNPs具有优于基础培养基的自由基清除能力，并与成骨培养基相当，说明其抗氧化特性有助于营造成骨环境。

结论

通过一锅法改性St?ber工艺，成功合成具有可调尺寸和形态的锶/钙掺杂BGNPs。乙醇作为共溶剂可细化颗粒尺寸、提升均匀性，而纯水溶剂产生类核壳大颗粒。两种BGNPs均保持高度缩合的非晶硅网络，Ca²⁺和Sr²⁺离子作为网络修饰剂掺入，并部分形成生物相容性碳酸盐结晶相。

细胞毒性呈现尺寸依赖性：SP-BGNPs（小尺寸）在高达10 μg/mL浓度下仍保持低毒性，而CS-BGNPs（大尺寸）在>0.1 μg/mL时毒性显著。离子释放实验证实，BGNPs的成骨促进作用主要源于Ca²⁺/Sr²⁺的持续释放，而非颗粒本身。此外，Sr²⁺掺杂赋予纳米颗粒显著抗氧化能力，能有效清除ROS，缓解氧化应激对成骨的抑制作用。

该研究证实，通过简单溶剂调控可优化BGNPs形态与尺寸，而不影响其成骨和抗氧化功能，为设计兼具成骨诱导与氧化应激缓解的双功能骨质疏松治疗平台提供了有力证据。未来工作应聚焦于体内疗效验证，并利用类核壳结构实现生物活性因子的可控递送。