综述：猪链球菌感染亚单位疫苗开发的十年进展与未来前景

本综述系统总结了近十年来猪链球菌（SS）亚单位疫苗研发的关键进展，重点介绍了SaoA、Ide、Enolase等高保护率抗原，以及病毒载体、OMVs等新型递送平台和佐剂策略的应用。文章指出，尽管在鼠模型中实现了100%保护，但实现猪的广谱、持久免疫仍需突破保守抗原发现、递送系统优化及转化验证等核心挑战。

　　

1 引言

猪链球菌（Streptococcus suis, SS），特别是血清型2（SS2），是一种重要的人畜共患病原体，在全球范围内引起猪业重大经济损失并威胁人类健康。该病原体自1951年在荷兰首次报道以来，已在亚洲多个国家的人类感染病例中发现，导致败血症、肺炎、脑膜炎和中毒性休克等严重病症。SS具有高度的遗传多样性，不同地区流行的血清型存在显著差异：北美以SS2和SS3为主，欧洲常见SS9，澳大利亚以SS6和SS7为主，而亚洲人类感染病例中则频繁报道SS2、SS7和SS9。这种区域性的血清型多样性对开发具有广谱交叉保护能力的疫苗提出了重大挑战。

传统灭活疫苗对同源菌株的保护率约为70%，对异源菌株的保护效果更差。此外，SS2在不同地区表现出不同的抗生素耐药模式：欧洲常见对林可酰胺类、大环内酯类和四环素类耐药，而β-内酰胺类仍有效；亚洲对这些抗生素的耐药率较高且不断增加，并出现对磺胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类的新兴耐药；北美的耐药谱与欧洲相似，但对β-内酰胺类和酰胺醇类的耐药率较低。SS2的高致病性和多重耐药性对公共卫生构成了严峻挑战，凸显了开发有效疫苗的迫切需求。

2 单亚单位疫苗

亚单位疫苗已成为对抗SS的关键策略，因其能诱导针对该病原体的强效特异性免疫应答。这些疫苗的核心在于利用从SS衍生的高免疫原性抗原，通过在大肠杆菌或其他工程菌株或病毒表达系统中的单一表达来生产。

Sao抗原

Sao蛋白（表面锚定蛋白）是一种高度保守的抗原（在主要猪链球菌血清型中同源性>94.2%），一直是SS疫苗研究的焦点。其免疫原性关键取决于递送平台和佐剂配方。最初在生物反应器中生产的重组Sao-L（rSao-L）建立了其免疫原性，在猪中诱导了强大的抗原特异性抗体和细胞应答（CD8⁺和CD4⁺/CD8⁺ DP T细胞增加）， upon异源攻击时病变减少60%。使用水包油包水（w/o/w）乳液佐剂引发了关于注射部位肉芽肿形成的潜在安全性问题。

随后的改进采用了母源疫苗接种策略：用重组Sao蛋白（rSao）和灭活菌苗组合免疫母猪。该方法通过初乳将被动免疫力从接种母猪转移给后代，显著改善了仔猪的保护效果，攻击后病变减少75-81%。然而，仔猪的抗体滴度在产后6周减弱。一项技术先进的方法使用展示脂化SaoA（Lpp-SaoA融合）的工程化外膜囊泡（OMVs），利用其内在佐剂性，在不使用外部佐剂的情况下诱导了优越、平衡的免疫应答和小鼠中的异常保护（高达100%存活率），但猪体评估尚未进行。

减毒沙门氏菌载体（如rSC0016, rSC0012）有效递送SaoA，在猪中诱导强大的黏膜和系统免疫，并提供强大的同源和异源（SS7）保护，其中rSC0012显示出改善的安全性。rSC0016载体已成功用于递送多种异源抗原。矛盾的是，尽管通过沙门氏菌载体诱导了针对多种血清型（SS2, SS7, SS9, SS1/2）的交叉反应性调理吞噬抗体（OPA），但单价SaoA提供的保护有限（如对SS9仅20%存活率）。这揭示了抗体滴度与体内功效之间的脱节，表明抗原的配方依赖性变异性和抗体功能性或未发现的血清型特异性表位变异的潜在问题。

荚膜多糖抗原

猪链球菌的荚膜多糖（CPS）是一个关键的毒力因子，但其低免疫原性给疫苗开发带来了重大挑战。研究发现，感染动物中的CPS特异性抗体反应通常缺失或仅轻微升高，主要由低滴度IgM组成。相比之下，实验性感染使用活毒SS2菌株 consistently在鼠和猪中诱导了强大的免疫应答，其特征是针对细菌蛋白的强效、同型转换的IgG抗体，并在再次攻击时表现出记忆特征。而针对CPS的抗体反应明显受损，微弱或常检测不到，主要由低滴度IgM组成，在两个动物模型中均未显示显著的向IgG的同型转换，并在再次暴露时仅引发最小的记忆增强。

为了解决这些挑战，研究人员探索了CPS糖缀合物疫苗。通过将纯化、解聚和氧化的CPS与破伤风类毒素（TT）偶联，并使用乳化佐剂（Stimune或TiterMax Gold）配制，在小鼠和猪中诱导了强大的、T细胞依赖性免疫应答。这包括针对CPS的高水平IgM和同型转换的IgG抗体（小鼠中为IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3，猪中为IgG1），其表现出功能性的体外调理吞噬活性（小鼠中64-98%的细菌杀灭）。关键的是，该缀合物疫苗在猪中对强毒SS2的致死性腹腔攻击提供了显著保护（70%存活率），与商业菌苗疫苗（72%存活率）相当，并显著减少了临床症状（异常行为、跛行）和关节中的细菌回收。此外，当与TiterMax Gold佐剂使用时，血清型3 CPS在小鼠中诱导了强大的调理IgG反应，而其他血清型（7, 8, 和9）的CPS未能引发显著的抗体反应。

IgA1蛋白酶和IgM蛋白酶抗原

IgA1蛋白酶和IgM蛋白酶因其在细菌发病机制和免疫逃避中的作用而成为猪链球菌疫苗的有希望的候选者。来自SS2的重组IgA1蛋白酶（rIgAP）与Marcol 52基佐剂结合时，在小鼠中诱导高水平IgG抗体并提供对致死性SS2攻击的完全保护。这一发现证实IgA1蛋白酶在细菌表面表达，使其成为潜在的表面保护性抗原。然而，其在猪中的功效尚未确认，突显了在相关动物模型中评估其潜力的进一步研究的需要。

类似地，IgM蛋白酶Ide-S.suis通过切割IgM破坏经典补体途径，在猪中对高毒力血清型9菌株提供保护。接种重组IgM降解酶（rIde）诱导了特异性IgG抗体并减少了血液中的细菌存活，导致接种仔猪在用猪链球菌cps9菌株致死剂量攻击后100%存活。但接种猪表现出发病迹象，如发热和跛行，表明是部分保护。

扩展这些见解，基于Ide-S.suis基因的IgM蛋白酶疫苗在猪中诱导了针对多种表达A组IgM蛋白酶的猪链球菌菌株的血清型非依赖性保护。该疫苗在仔猪和后备母猪接种研究中均有效，提供针对各种菌株的保护，包括st1, st2, st9, 和st14。未观察到针对表达B组IgM蛋白酶菌株的保护，突显了更全面抗原覆盖的必要性。该研究还开发了一种qPCR测试，根据其IgM蛋白酶组对猪链球菌菌株进行分类，这可能有助于预测疫苗功效。虽然IgA、IgG和IgM蛋白酶已显示出作为疫苗候选者的前景，但几个局限性仍然存在，包括血清型特异性功效和对某些菌株的不完全保护。需要在相关动物模型中进行进一步的体内研究以改善交叉保护并确认整体功效。

ABC转运蛋白抗原

PstB被鉴定为一种高度保守的蛋白，在各种猪链球菌分离株中具有近100%的氨基酸序列同一性。用重组PstB（rPstB）免疫诱导高水平的IFN-γ和IL-4，表明强大的Th1和Th2免疫应答。用rPstB免疫的小鼠对SS2（87.5%存活）、SS7（62.5%存活）和SS9（87.5%存活）的攻击显示出显著保护。PstB的多表位构建体对所有测试血清型提供较差的保护（12.5%存活）。

S-ABC被发现在多个SS菌株中高度保守，具有97%的氨基酸序列同一性。用重组S-ABC（rS-ABC）免疫的小鼠表现出强大的抗原特异性抗体反应和显著的IFN-γ和IL-4产生，表明强大的Th1和Th2免疫应答。该疫苗对SS2（87.5%存活）和9（100%存活）的攻击提供高水平保护，和对血清型7的中等保护（50%存活）。相比之下，S-ABC的多表位构建体提供较低的保护（25%-37.5%）。这些结果表明全长rS-ABC是针对多种SS血清型的通用亚单位疫苗的有希望候选者，尽管需要进一步研究以优化其功效并探索其在更广血清型覆盖中的潜力。

此外，研究人员合成了类似猪链球菌血清型2、3、9和14的CPS的寡糖，鉴定了有潜力引发免疫反应的先导抗原。虽然这项工作为糖缀合物疫苗开发奠定了基础，但它仍处于早期阶段，尚无体内功效数据可用。同样，研究人员报道了猪链球菌血清型18寡糖的合成，克服了合成五糖重复单元的挑战。这项研究为未来的糖缀合物疫苗开发提供了基础，但尚未评估合成抗原的体内免疫原性或保护功效。

烯醇化酶抗原

重组猪链球菌烯醇化酶（SsEno）和二肽基肽酶IV（DPPIV）亚单位疫苗，尽管分别由86%和88%的田间菌株表达并在小鼠中诱导强抗体反应，但未能在外周（CD-1）小鼠模型中对致死性血清型2攻击提供显著保护。这种保护的缺乏与使用的佐剂（Quil-A^?, Polygen?, Stimune^?, 或 Montanide? ISA 50 V2）无关，证明在这些实验条件下，单独佐剂优化不能赋予这些抗原功效。

然而，一项使用重组猪霍乱沙门氏菌载体（rSC0016）携带烯醇化酶抗原的研究在小鼠中实现了对SS2和SS9的100%保护，和对SS7的80%保护。该研究评估了一种减毒猪霍乱沙门氏菌载体（rSC0016）递送一种保守表面蛋白烯醇化酶作为针对多种猪链球菌血清型的潜在通用疫苗。烯醇化酶是一种高度保守的表面蛋白，存在于所有猪链球菌血清型中，由rSC0016(pS-Enolase)疫苗株表达。结果表明，该疫苗株有效定植小鼠淋巴组织，并引发针对烯醇化酶的强大黏膜、体液和细胞免疫应答。

基于这些观察，研究人员使用猪霍乱沙门氏菌构建了双抗原表达盒，在小鼠中对多种猪链球菌血清型（2, 7, 9, 和1/2）提供广泛保护，保护率从80%到100%不等。这种结合Sao和Enolase的双抗原方法展示了通过利用多种保守抗原的优势来增强保护性免疫的潜力。结果强调了组合抗原以开发针对多种猪链球菌血清型的通用疫苗的重要性，表明多抗原策略可能在提供广谱保护方面更有效。

其他亚单位抗原

其他亚单位疫苗，如6-PGD、PDH、SsnA、EF-Tu、PrsA和SBP2，已在小鼠和兔中显示出显著的免疫原性和不同程度的保护。

研究人员开发了一种减毒猪霍乱沙门氏菌疫苗载体（rSC0011），结合了调节延迟减毒和调节延迟抗原合成，以递送来自SS2的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGD）蛋白。疫苗株rSC0011与 licensed疫苗株C500相比，表现出显著减毒并增强在小鼠淋巴组织中的定植。用rSC0011(pS6-PGD)免疫的小鼠发展了强大的免疫应答，包括针对6-PGD和沙门氏菌抗原的高水平血清IgG和黏膜IgA抗体。该疫苗对SS2致死剂量的腹腔攻击赋予90%保护，证明其作为有效疫苗候选者的潜力。

丙酮酸脱氢酶（PDH），一种SS的生物膜相关蛋白，也是一个亚单位疫苗候选者。从大肠杆菌表达和纯化的重组PDH（rPDH）与ISA206佐剂一起用于免疫小鼠。结果显示，PDH在不同猪链球菌血清型间具有高序列保守性和强免疫原性，诱导高水平特异性抗体（滴度高达1:409,600）和小鼠脾脏中免疫相关基因（CD4, CD8, IFN-γ, 和IL-6）的显著表达。用rPDH或灭活细菌免疫的小鼠分别对猪链球菌ZY05719致死剂量表现出70%和60%的存活率，并减少了肝、脑和脾等重要器官的病理损伤。此外，PDH抗血清在体外显著抑制猪链球菌生长和生物膜形成。然而，该研究仅限于单一血清型2，其跨其他血清型的功效仍有待确定。

此外，基于其他蛋白如SsnA、EF-Tu、PrsA和SBP2的疫苗已在小鼠和兔中显示出不同程度的保护。特别是，rSsnA + ALOH疫苗对SS的保护率达到91.25%，显著降低死亡率和细菌计数。一些蛋白，如PrsA和SBP2，已显示出对多种血清型的部分交叉保护。然而，大多数研究仅限于小鼠模型，其在自然宿主（如猪）中的功效尚未测试。

在病毒载体领域，BoHV-4/GMD疫苗对SS2攻击实现了71.4%的保护率，而BoHV-4/SLY仅提供12.5%的保护。该研究表明，与BoHV-4/SLY相比，BoHV-4/GMD诱导了更高水平的针对SS2、SS7和SS9的抗体介导的吞噬活性。尽管该研究为BoHV-4/GMD作为潜在疫苗候选者提供了有希望的结果，但发现受到使用兔模型的限制，这可能不能完全复制猪的免疫应答。此外，由于缺乏适用于这些血清型的兔模型，该研究未直接评估对SS7和SS9的保护功效。

3 多亚单位疫苗

多亚单位疫苗通过组合多种抗原以增强免疫应答并增加跨不同血清型的交叉保护，在提供针对猪链球菌的更广泛保护方面显示出前景。

最初的努力集中于膜相关蛋白，如Ldh、Dldh、Pec和Sbp，其中Sbp显示出最有希望的结果，引发强大的体液免疫应答并在小鼠中提供对致死攻击的保护。随后的研究通过功能基因组筛选鉴定了其他蛋白（SSU0185、SSU1215、SSU1355、SSU1773、SSU1915），这些蛋白诱导了强大的免疫应答，包括IgG抗体和细胞介导免疫，并对强毒猪链球菌提供显著保护。这些疫苗的功效高度依赖于佐剂的选择，Carbopol-AddaVax和Emulsigen-D显示出特别的前景。

创新性递送方法也显示出潜力。例如，V5多亚单位疫苗（包含SrtA、SspA、SLY、MRP和ScpCL毒力因子与CpG ODN佐剂）的鼻内给药促进了小鼠强大的黏膜免疫，导致鼻咽部猪链球菌的显著清除和对系统SS2攻击的高同源保护。尽管有这些成功，一些候选者如DPPIV和烯醇化酶（SsEno）未能提供小鼠保护，突显了进一步优化的需要。蛋白质组学和生物信息学分析在猪链球菌人类分离株中鉴定出131个预测表面蛋白，为疫苗候选者测试提供了资源，但体内免疫原性和保护能力尚未评估。

工程方法在增强疫苗功效方面显示出潜力。BP制剂如38-BP-Enol和SSU1-BP-SSU2诱导了显著的抗原特异性体液免疫应答，IgG滴度高达1.0×10⁷，并在接种小鼠中提供100%存活，而对照组为70%。类似地，如IF-2和1022等蛋白对SS2和SS9的致死剂量提供交叉保护，具有高抗体滴度和攻击实验中的显著保护。然而，由六种保守免疫原组成的多组分疫苗在仔猪用猪链球菌cps14攻击时未能证明显著保护。相比之下，三价蛋白疫苗（JointS）与TLR4激动剂（MPLA）结合在小鼠中对SS2感染提供完全保护，并在仔猪中提供良好保护。此外，使用Tat途径分泌猪链球菌抗原的工程化大肠杆菌株在接种小鼠中显示出更高的存活率和更轻微的临床症状。然而，必须仔细评估基因转移和环境污染的风险。多表位疫苗（如MVSS）和MEASs也在小鼠模型中显示出强大的免疫原性和部分保护，一些配方表现出优越的功效。这些研究强调了多亚单位疫苗的潜力，但也强调需要进一步优化以实现广谱保护。

4 SS疫苗中的动物模型

在猪链球菌亚单位疫苗的开发中，已采用多种动物模型来评估功效、免疫原性和保护。这些模型包括小鼠、猪、兔和斑马鱼，每种都有 distinct 的角色、优势和局限性。

小鼠是最普遍用于初步功效筛选、免疫应答分析（抗体滴度、细胞因子水平）和攻击研究的模型。使用小鼠的优势包括其低成本、短繁殖周期和易于遗传操纵。此外，特征明确的免疫工具包，如BALB/c和C57BL/6品系，促进了抗原和佐剂的高通量筛选。例如，涉及OMVs和沙门氏菌载体的研究受益于小鼠的可扩展性和遗传可操作性。然而，小鼠不是SS的自然宿主，其病理生理学可能不能准确反映猪或人类的疾病。这种限制在如SS脑膜炎等条件下尤其明显，这些条件在小鼠中建模不佳。此外，在小鼠中优化的疫苗通常不能有效地转化到猪，突显了对于交叉血清型保护的有限转化相关性。

猪对于转化验证至关重要，特别是在评估母源疫苗接种和田间相关血清型攻击时。作为SS的自然宿主，猪重现了临床病理，包括败血症和脑膜炎，使其对于评估被动免疫（如母猪到仔猪的抗体转移）和田间菌株的功效至关重要。然而，猪的使用受到高成本、伦理考虑和物流复杂性的限制。此外，猪的遗传异质性可能引入疫苗应答的变异性，使结果解释复杂化。

兔具有利基应用，特别是在研究如BoHV-4等病毒载体疫苗时。其较大的体型便于外科手术和采血，使其对于人畜共患菌株的免疫原性研究有用。尽管有这些优势，兔不是SS的自然宿主，其免疫机制可能不能反映猪的机制。而且，兔对于多血清型攻击的效用有限，因为对于某些血清型如SS7和SS9没有建立的兔模型。

斑马鱼代表了一种用于快速体内筛选的新兴模型，例如涉及joints三价疫苗与TLR4激动剂结合的研究。斑马鱼的透明度使得能够实时成像免疫应答，其高繁殖力和遗传可操作性使其适用于大规模筛选。然而，它们与哺乳动物的进化距离和缺乏适应性免疫复杂性限制了其对于SS病理学和交叉保护研究的适用性。

5 SS疫苗的佐剂

佐剂在增强细菌疫苗的免疫原性和功效方面起着至关重要的作用。多年来，在SS2亚单位疫苗的开发中探索了各种佐剂，一些显示出免疫应答的显著增强，而其他则表现出有限或无效果。

弗氏完全和不完全佐剂已广泛用于实验研究，并显示出免疫应答的强烈增强。例如，在涉及Sao蛋白和CPS-TT缀合物的研究中，弗氏佐剂诱导了高水平IgG抗体和强大的Th1/Th2免疫应答，导致小鼠和猪中对致死攻击的显著保护。Quil-A，一种皂苷基佐剂，在增强黏膜和系统免疫应答方面有效。在使用重组SaoA通过沙门氏菌载体递送的研究中，Quil-A显著提升了IgG和IgA水平，提供对SS2和SS7的强大保护。TiterMax Gold显示出调理IgG应答的显著增强，特别是在CPS基疫苗中。例如，与TiterMax Gold佐剂的CPS3在小鼠中诱导了强大的调理IgG反应，突显了其增强疫苗功效的潜力。Stimune也已用于CPS-TT缀合物疫苗，诱导高水平IgG抗体并在猪中对致死攻击提供显著保护。ISA 206 VG在多表位疫苗中有效增强IgG反应，在小鼠中对SS2和SS9提供显著保护。

另一方面，一些佐剂显示出有限或无效果。氢氧化铝（AlOH），虽然常用，但在一些研究中显示增强免疫应答的功效有限。例如，在CPS基疫苗中，AlOH未能诱导显著的抗体反应，突显了其潜在局限性。Montanide ISA206在一些涉及烯醇化酶和其他亚单位疫苗的研究中，尽管诱导高IgG滴度，但未提供显著保护。Polygen?在一些研究中也显示出免疫应答的有限增强，特别是在如rDPPIV等亚单位疫苗中，其未能对SS2攻击提供显著保护。未来研究应专注于优化佐剂配方和探索新型佐剂以改善疫苗功效和安全性。

6 结论

过去十年中，对SS亚单位疫苗的评估已鉴定出几种在鼠和仔猪模型中对致死SS2攻击提供完全（100%）保护的抗原。值得注意的是，只有三种抗原，SaoA、Ide r10和Ide r10049，在仔猪中证明了100%保护，而其他有希望的候选者如pS-Lpp-SaoA（通过OMVs递送）、IgA1蛋白酶、rIde-14009-1、Enolase、6-GPD、38-BP-Enol和各种组合（如MRP/GAPDH/DLD或SLY/Enolase/Sbp）在小鼠中显示出100%保护。然而，这些候选者大多数尚未在猪中实现100%保护。为了弥合小鼠模型和自然宿主之间的功效差距，未来研究需要专注于在猪中使用生理相关攻击模型和免疫途径进行验证。在猪中识别保护免疫相关物，如调理抗体或黏膜IgA应答，对于指导合理的疫苗设计和佐剂选择至关重要。未来努力应专注于识别新的免疫原性蛋白和佐剂，以开发能在目标物种如猪中提供更广泛保护的疫苗。