基于网络药理学、分子对接与体外实验探索药用拟层孔菌三萜酸靶向CASP3调控胃癌细胞凋亡机制及其治疗潜力

本研究通过整合网络药理学、分子对接与体外实验，首次系统揭示药用拟层孔菌（FOA）三萜酸通过调控神经活性配体-受体相互作用通路及核心靶点（CASP3、EGFR）抑制胃癌细胞增殖、迁移并诱导G1期阻滞与凋亡的分子机制，为天然来源抗胃癌药物开发提供理论依据。

　　

1 引言

胃癌（GC）作为全球高发恶性肿瘤，尤其在亚洲地区和中国具有较高的发病率和死亡率，是威胁人类健康的重大疾病。其发病机制涉及多因素、多基因调控及多阶段参与，包括环境因素、饮食习惯、病原体感染（如幽门螺杆菌）等复杂过程。当前治疗手段包括手术、化疗、放疗、靶向药物和免疫治疗，但多数患者确诊时已处于晚期，转移扩散限制了手术机会，药物治疗成为维持病情的主要方式。随着中药研究的深入，从草药中提取的天然产物因其低毒性和较少副作用，同时表现出抗肿瘤特性，显示出巨大的开发潜力。

药用拟层孔菌（Fomes officinalis Ames，FOA），又称阿里红，属于多孔菌科，是传统民族药材，具有温胃化痰、理气平喘、祛风除湿、消肿利尿等功效，常用于治疗慢性支气管炎和多种癌症。文献报道，FOA的三萜类成分能提高荷瘤小鼠脾指数和IL-2水平，增强机体免疫功能，并通过影响肿瘤细胞周期进展和诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。三萜酸成分还能通过增加活性氧（ROS）水平、调节Bax和Bcl-2蛋白表达，诱导线粒体膜电位下降、细胞色素C释放和Caspase级联反应，最终激活Caspase-3诱导凋亡。FOA三萜酸在预防和治疗多种肿瘤疾病方面显示出显著效果，特别是对肝癌、胃癌和结肠癌具有显著预防作用。

网络药理学作为系统识别疾病-药物-靶点关系的工具，有助于拓宽对药物生物学和药理作用的理解。本研究采用网络药理学方法，通过HERB、SwissTargetPrediction等数据库筛选FOA的有效成分和潜在靶点，与胃癌相关基因取交集，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，识别核心通路，并通过分子对接探讨关键靶点与活性成分的相互作用，阐明其在胃癌中的抑制机制。体外实验验证了FOA对人胃癌MKN-45细胞的抗癌作用及关键靶点。

2 材料与方法

2.1 FOA抗胃癌潜在靶点筛选

通过HERB数据库检索FOA（阿里红）的所有化学成分，获取PubChem ID和结构信息。使用胃肠道（GI）吸收和Lipinski五规则（miLogP ≤5、nOHNH ≤5、nOH ≤10）初步筛选，再通过SwissADME数据库结合Ghose、Veber、Egan和Muegge规则进一步鉴定有效活性成分，最终确定5个有效活性成分。利用Swiss Target Prediction数据库预测这些活性成分的靶点，获得379个药物-靶点相互作用。以“胃癌”为关键词在GeneCards数据库检索，获得14,092个胃癌相关靶点。通过SRplot绘制Venn图，取药物与疾病靶点交集，得到329个共同靶点。

2.2 药物-疾病共同靶点与PPI互作网络构建

将交集靶点输入STRING数据库，设置物种为“Homo sapiens”，互作阈值0.9，获得更紧密连接的蛋白质网络，构建包含328个节点和4,486条边的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用Cytoscape 3.10.3软件进行可视化和网络拓扑分析，移除孤立节点，节点大小和颜色深度表示连接度值，连接度高的靶点在网络中起关键作用。

2.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析

将共同靶点导入DAVID数据库，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并按p值排序细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。下载数据，选择前10个核心靶点，导入MicroSignal平台生成气泡图，进行GO和KEGG分析。

2.4 分子对接

从PubChem数据库获取5个活性成分，保存为SDF格式，使用Chem3D 2020软件通过分子力场优化获得最低能量状态分子结构。识别5个与活性成分密切相关的核心靶点：AKT1（PDB ID: 1H10）、SRC（PDB ID: 1A07）、EGFR（PDB ID: 1M14）、BCL2（PDB ID: 1QX3）和CASP3（PDB ID: 1GFW）。使用AutoDock Vina 3.10.3进行分子对接，结合能低于-7.00 kcal/mol表示结合强度满意。选择前6个分子对接结合能进行PyMOL可视化分析。

2.5 FOA三萜酸提取物制备

取适量FOA药材块，用10倍体积90%乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，减压浓缩至原体积1/5，得FOA三萜酸粗提物。将粗提物上样至预处理D101大孔吸附树脂柱，以2 mL/min流速上样，用90%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干溶剂得纯化FOA三萜酸。以脱水硫磺酸和脱氢依布里酸含量为评价指标，通过HPLC分析确定制备方法，结果显示方法可行、工艺稳定可靠。

2.6 细胞培养与细胞增殖检测

人胃癌MKN-45细胞购自子善生物技术有限公司，培养于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37°C、5% CO₂湿润培养箱培养。使用CCK-8 assay评估FOA三萜酸提取物对细胞增殖的影响，添加不同浓度提取物（0、7.5、15、30、60、120 μg/mL），对照组（0 μg/mL）使用含10% FBS的RPMI 1640培养基。处理24和48小时后，加入10% CCK-8试剂，37°C孵育2小时，用酶标仪在450 nm测量光密度（OD），计算半最大抑制浓度（IC₅₀）。

2.7 划痕实验与Transwell实验检测细胞迁移能力

使用无菌200 μL移液器头在细胞单层上划直线，弃旧培养基，PBS缓冲液洗涤细胞。各组饥饿细胞用不同浓度FOA三萜酸提取物（20、40、80 μg/mL）处理24小时，对照组（0 μg/mL）使用含10% FBS的RPMI 1640培养基。处理后立即显微照相（记为0小时），返回培养箱继续培养，24小时后再次照相观察细胞迁移。

Transwell实验分为对照组（0 μg/mL）和三个浓度处理组（20、40、80 μg/mL）。Matrigel 4°C过夜解冻，操作时保持冰上，RPMI 1640培养基与Matrigel基质按1:8比例混合，取50 μL稀释Matrigel加入Transwell上室，固化后接种MKN-45细胞（5 × 10⁵ cells/insert），下室加入500 μL含20% FBS培养基，培养48小时。取出上室，棉签轻轻擦拭膜内侧面去除未迁移细胞，膜洗涤两次，固定，结晶紫染色，再洗涤，倒置晾干。显微镜下观察迁移至膜外侧的MKN-45细胞，随机选择三个清晰视野成像和计数。

2.8 流式细胞术检测细胞周期与凋亡

用不同浓度FOA三萜酸提取物（20、40、80 μg/mL）处理细胞24小时，对照组（0 μg/mL）同样收集，进行流式细胞术分析。使用细胞周期检测试剂盒（2024R1E）和细胞凋亡检测试剂盒（2024F2K），按制造商说明染色细胞，使用小型流式细胞仪-3F-3（Apogee, UK）分析。

2.8.1 详细步骤

细胞收集：处理24小时后收集处理组和对照组细胞。

细胞周期分析：使用细胞周期检测试剂盒染色，按协议操作，流式细胞仪分析细胞周期分布（G0/G1、S、G2/M期）。

凋亡分析：使用细胞凋亡检测试剂盒染色，按协议操作，流式细胞仪评估凋亡细胞百分比。

通过这些分析，评估FOA三萜酸提取物对MKN-45细胞周期分布和凋亡率的影响。

2.9 比色法检测细胞内Caspase-3活性

收集用不同浓度FOA三萜酸提取物（20、40、80 μg/mL）处理48小时的细胞，对照组（0 μg/mL）同样收集。细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心弃上清，PBS洗涤后再次弃上清。加入50 μL裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上裂解30分钟，涡旋3次每次10秒。4°C、12,000 rpm离心10分钟，小心收集上清转移至新管，冰上保存用于Caspase-3活性检测。使用南京建成生物工程研究所Caspase-3活性检测试剂盒（G015-1-1），按说明操作，37°C孵育4小时，颜色变化明显时用酶标仪在405 nm测量吸光度（A₄₀₅），计算Caspase-3活性单位（U），实验重复三次。

2.10 统计分析

使用GraphPad Prism软件（版本9）进行统计分析，每个梯度设三个重复，结果以均值±标准差（SD）表示。数据符合正态分布时，使用单因素方差分析（ANOVA）比较多组，p值<0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 FOA抗胃癌潜在靶点预测与PPI网络构建

从PubChem数据库获得FOA有效活性成分的化学结构（图1A–E）。从GeneCards数据库检索胃癌相关基因，取交集可视化，共329个交集基因（图1F）。使用Cytoscape 3.10.3软件构建这些交集基因的PPI网络，节点颜色越深表示连接度越高。连接度值最高的前5个基因是AKT1、SRC、EGFR、BCL2和CASP3（图1G），表明FOA可能通过作用于多个靶点发挥抗肿瘤作用。

3.2 GO与KEGG通路富集分析

使用DAVID数据库对329个共表达基因进行GO和KEGG通路富集分析，阐明FOA在胃癌治疗中的作用。GO富集分析结果（图2A）显示，FOA-胃癌核心共同靶点关联的生物过程包括：MAPK激酶活性正调控、对外部刺激的反应、G蛋白偶联受体-环核苷酸信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）级联正调控；核心药物-疾病共同靶点基因集主要富集在细胞组分如质膜、细胞质、受体复合物、树突、突触；分子功能主要涉及组蛋白H2AX Y142磷酸化活性、组蛋白H3 T41磷酸化活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性、酶结合。

KEGG通路富集分析结果（图2B）选择p值<0.05的通路，代表性富集信号通路包括神经活性配体-受体相互作用通路、癌症通路、钙信号通路、cAMP信号通路和血清素能突触。

3.3 分子对接

基于PPI网络分析结果，选择5个关键靶点基因与FOA的5个有效成分进行分子对接。对接结果如图3A所示，5个靶蛋白与FOA5个活性成分的结合能均低于-6 kcal/mol。具体而言，麦角胺与CASP3形成3个氢键、与EGFR形成2个氢键、与BCL2形成5个氢键、与SRC形成5个氢键。Officinalic acid与CASP3形成2个氢键、与EGFR形成4个氢键。这些结果表明关键活性成分与核心靶点之间存在强结合亲和力（图3B,C）。

3.4 FOA三萜酸提取物指标成分HPLC分析

使用分析柱（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）进行HPLC分析，流动相为乙腈（A）和0.4%磷酸（B），梯度洗脱程序：0-8分钟80%-90% A，8-20分钟90%-95% A。进样体积10 μL，检测波长242 nm，流速1.0 mL/min，柱温30°C。分析结果如图4所示，两个指标成分的保留时间分别为4.37分钟和16.71分钟，峰形良好，表明方法在测定FOA三萜酸提取物中脱水硫磺酸和脱氢依布里酸时无干扰。峰1：脱水硫磺酸（65.45 mg/g）；峰2：脱氢依布里酸（27.05 mg/g）。

3.5 FOA抑制胃癌细胞增殖与迁移

使用CCK-8 assay评估FOA三萜酸提取物对MKN-45胃癌细胞增殖的影响。用不同浓度提取物（0、7.5、15、30、60、120 μg/mL）处理细胞24和48小时后，细胞增殖能力随药物浓度和时间增加而降低，表明FOA三萜酸提取物抑制MKN-45细胞增殖。此外，使用GraphPad Prism计算FOA三萜酸提取物对MKN-45细胞在24和48小时的IC₅₀值分别为41.26 μg/mL和16.21 μg/mL（图5A,B）。因此选择20、40和80 μg/mL浓度进行后续实验。划痕实验显示，细胞迁移随FOA三萜酸提取物浓度增加显著减少（图5C）。Transwell侵袭实验观察到类似结果（图5D）。

3.6 FOA诱导胃癌细胞G1期阻滞并促进凋亡

用20、40和80 μg/mL浓度FOA三萜酸提取物处理胃癌细胞，研究细胞周期和凋亡变化。如预期，FOA诱导细胞周期G1期阻滞（图6A）并促进凋亡（图6B）。凋亡率随提取物浓度增加而升高。这些结果共同表明FOA三萜酸提取物可抑制MKN-45细胞增殖并促进凋亡。

3.7 FOA对关键核心蛋白的影响

Caspase-3是死亡受体介导凋亡通路的关键启动子。Caspase-3可通过寡聚化和切割自我激活，随后激活下游半胱氨酸蛋白酶产生凋亡效应。Caspase-3在诱导凋亡和抑制细胞增殖中起重要作用，广泛表达于正常人体组织以及肺癌、胃癌、壶腹癌和乳腺癌等多种肿瘤组织。实验结果显示，用20、40和80 μg/mL浓度FOA三萜酸提取物处理MKN-45细胞后，Caspase-3表达水平随浓度增加逐渐升高。与对照组相比，这些差异具有统计学意义（P < 0.001），如表1所示。这些发现表明FOA三萜酸提取物通过增强Caspase-3表达诱导胃癌细胞凋亡。

4 讨论

胃癌是消化系统高发恶性肿瘤，全球广泛存在，因此寻找有效的预防和治疗药物至关重要。三萜类是一类具有30个碳原子基本核的萜类化合物，可视为六个异戊二烯单元聚合物，是天然产物的重要化学成分。一种五环三萜类化合物桦木酸在体外和体内均表现出抗肿瘤效果，涉及十多种恶性肿瘤，包括肺癌、结直肠癌和胃癌。桦木酸在多种中药中高浓度存在，如桦树皮、酸枣仁、杜仲、枣核、鸡骨草、通光藤和夏枯草。先前研究已证实FOA三萜酸成分（弗瑞德林型三萜类）对多种肿瘤疾病具有显著预防和治疗效果，特别是在预防肝癌和结直肠癌方面。有研究人员报道，药用层孔菌石油醚提取物在体外抑制人肝癌细胞SMMC-7721、人胃癌细胞SGC-7901和人喉癌上皮细胞HEP-2增殖。研究发现FOA主要三萜酸成分3-酮-脱水硫磺酸显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖。FOA三萜酸对多种肿瘤细胞增殖显示出抑制效果。此外，在人肺腺癌A549细胞系上进行的体内抗肿瘤实验已取得 promising 结果。然而，对人胃癌细胞的研究迄今仅限于细胞增殖水平，尚未进一步探讨具体机制或体内研究。

本研究采用网络药理学方法筛选出FOA的5个有效成分（弗瑞德林型三萜类）。使用分子对接技术发现这5个有效成分及其关键分子靶点（AKT1、CASP3、EGFR、BCL2、SRC）均表现出强结合亲和力。然而，化合物如Dehydrofalcarinol、Eburnamonine、Ergotamine和Sulfuretin在文献中未特别报道。相比之下，Officinalic acid作为FOA三萜酸成分之一已有充分文献记载。Officinalic acid与FOA其他三萜酸可通过增加ROS水平、改变Bax和Bcl-2蛋白表达诱导凋亡，具体为增加Bax蛋白表达、减少Bcl-2蛋白表达，导致MPTP开放，线粒体膜电位下降，线粒体内相对高渗，基质肿胀、外膜破裂，细胞色素C释放，激活Caspase级联反应，最终激活Caspase-3诱导凋亡。因此，我们选择测量Caspase-3含量以验证分子对接结果。

为探索FOA（弗瑞德林型三萜类）治疗前列腺癌的潜在机制，我们进行GO和KEGG富集分析，研究FOA靶点关联的生物学功能和信号通路。GO富集分析结果表明，FOA正调控几个关键过程，包括MAPK激酶活性、对外源刺激的反应、G蛋白偶联受体-环核苷酸信号通路、磷脂酶C在G蛋白偶联受体信号通路中的激活、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）级联通路正调控。KEGG富集分析结果显示，FOA主要调节几个信号通路，包括神经活性配体-受体相互作用、癌症相关通路、钙信号通路、cAMP信号通路和血清素能突触。这些通路参与FOA在胃癌中的治疗作用。总之，FOA在胃癌中的核心共同靶点与癌细胞在多个水平密切关联，包括生物过程、细胞组分、分子功能和KEGG信号通路。在生物过程水平，FOA参与细胞增殖和信号转导等关键过程调控。在细胞组分内，FOA富集于物质交换和信号转导的关键位点。在分子功能方面，FOA涉及各种激酶活性和酶结合，对细胞功能至关重要。在KEGG通路中，FOA覆盖几个重要信号通路，包括神经调节、癌症发展和关键信号级联。这些结果揭示了FOA作用于胃癌细胞的潜在分子机制和靶点网络。FOA在多个水平调节多种细胞过程，包括增殖、迁移、侵袭、细胞周期进展和凋亡，为前列腺癌治疗提供新的分子机制和潜在干预靶点。

为验证FOA三萜酸提取物抑制人胃癌MKN-45细胞增殖和促进凋亡的效果，我们进行细胞实验。结果显示FOA有效抑制MKN-45细胞增殖。使用CCK-8 assay检测FOA三萜酸对MKN-45细胞增殖的抑制效果，发现半最大抑制浓度（IC₅₀）为41.26 μg/mL，表明FOA作为人胃癌治疗药物的潜力。此外，划痕实验和Transwell实验证明FOA三萜酸以剂量依赖性方式抑制MKN-45细胞迁移和侵袭能力。而且，FOA三萜酸诱导G1期细胞周期阻滞并显著促进凋亡。Caspase-3活性检测显示，Caspase-3水平随药物浓度增加而升高。这些发现共同证明FOA三萜酸提取物对胃癌的治疗效果通过抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导凋亡，G1期细胞周期阻滞和提升Caspase-3水平实现。

我们综合网络药理学、分子对接和体外实验的方法表明，FOA三萜酸提取物具有抗胃癌特性。这些效果通过调节膜受体介导的凋亡信号（经由“神经活性配体-受体相互作用”通路）和靶向Caspase-3及上游受体/激酶激活凋亡通路介导。鉴于Caspase-3是凋亡的关键执行者，其编码基因参与调节膜受体介导凋亡的通路，可以合理假设FOA三萜酸（包括Officinalic acid）通过靶向Caspase-3促进胃癌细胞凋亡。

本研究为FOA在胃癌中的治疗机制提供参考，特别关注凋亡调控。通过网络药理学、分子对接和实验方法获得的研究结果可靠，但仍有一些局限性。需要通过体内实验和蛋白水平分析进一步验证。此外，FOA开发成新型抗肿瘤药物的潜力需要进一步评估其成药性。未来研究可解决这些局限性，以进一步阐明FOA在胃癌治疗中的作用及其临床适用性。总之，FOA通过靶向关键通路和蛋白，在胃癌中表现出显著的抗增殖和促凋亡效果，这为将FOA开发成新型抗胃癌药物奠定了理论基础，并将其定位为治疗胃癌的有前途候选药物。