金莲花残渣膳食补充对断奶兔生长性能、抗氧化状态、肠道形态及盲肠微生物群的影响研究

本综述系统探讨了金莲花残渣（TCBR）作为饲料添加剂对断奶兔生长性能、抗氧化能力、肠道健康及盲肠微生物群的积极影响。研究发现，低剂量（2%）TCBR可显著提高存活率、改善饲料转化率（FCR）、增强抗氧化酶（如SOD、CAT）活性、优化肠道形态（如绒毛高度/隐窝深度比V/C）并上调紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）表达，同时调节盲肠菌群（如提升Bacteroidota和Akkermansia丰度）。这些结果为TCBR在畜牧业中的应用提供了理论依据。

　　

1 引言

兔肉因其高营养价值（富含多不饱和脂肪酸、蛋白质和必需氨基酸）而备受关注，全球兔肉生产主要集中在亚洲（占70%），中国是主要生产国。断奶后10-15天是兔子 postnatal 发育的关键期，此时易发生胃肠道感染，导致死亡率增加、生长迟缓及经济损耗。随着“禁抗”政策的实施，中国兔场健康问题加剧，因此通过外源补充剂进行营养调控已成为研究热点。传统中药（TCM）以其安全性、制备简单、成本低和副作用小等优势，被广泛用于预防和治疗人与动物的多种疾病，包括作为抗菌、抗炎、抗寄生虫和抗腹泻剂。研究表明，中药残渣富含生物活性化合物，对动物具有多种营养和健康益处。动物健康与免疫稳态密切相关，而清除和抑制炎症因子是维持健康的关键。NF-κB通路是多种促炎因子表达的关键调节因子和炎症反应的重要介质。多项研究表明，中药残渣通过NF-κB通路调节炎症因子表达，从而对动物生理产生有益影响。此外，一些中药残渣混合物可降低IL-4、IL-1β和TNF-α等炎症标志物的表达水平，进而提高鸡的产蛋量。肠道作为人体最大的免疫器官，通过其常驻肠道菌群在免疫调节中发挥重要作用。膳食补充板蓝根残渣可减少有害肠道细菌（如弯曲杆菌、小放线杆菌和皮氏拉尔斯顿菌）的流行，这些减少有助于增强肠道屏障完整性并减轻早期断奶相关的腹泻。孙等人证明，夏桑菊残渣增加了有益细菌（如约氏乳杆菌和赵氏魏斯氏菌）的相对丰度，同时减少了有害细菌（如大肠杆菌和猪密螺旋体）的相对丰度。此外，这种补充导致回肠中IL-10表达增加和IL-1β表达减少，从而改善肠道紧密连接屏障的完整性。金莲花（Trollius chinensis Bunge）是毛茛科多年生草本植物，因其抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒特性而具有较高的药用价值。这些益处归因于其丰富的生物活性化合物，如黄酮类、有机酸和生物碱。研究评估了金莲花的毒性，证实其在动物饲料中的低毒性和安全性。然而，迄今为止，尚无研究评估金莲花残渣（TCBR）在肉兔生产中的作用。本研究旨在探讨TCBR补充对断奶兔生长性能、血清生化指标、抗氧化能力及盲肠微生物群的影响，为TCBR作为饲料添加剂促进健康养兔提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 金莲花残渣成分测定

采用超高效液相色谱（UPLC）技术分析TCBR的主要活性成分。将干燥的金莲花残渣粉碎后放入药袋中浸泡2小时，随后煮沸并煎煮两次，浓缩得到金莲花残渣水提物。取200μL药液与800μL甲醇混合，涡旋10分钟，然后在13,000 rpm下离心10分钟，收集上清液进行分析。色谱分离使用Welch AQ-C18柱，流动相为0.1%甲酸水（溶剂A）和甲醇（溶剂B）。洗脱梯度条件为：0-10分钟，2-20% B；10-15分钟，50-80% B；15-20分钟，80-95% B；20-27分钟，95% B；27-28分钟，95-2% B；28-30分钟，2% B。进样量为5μL，流速为0.3 mL/min，检测波长为254 nm。此外，采用Q Exactive高分辨率质谱仪进行分析，使用电喷雾电离（ESI）源，在正负离子模式下操作。数据采集采用数据依赖采集（DDA），动态背景扣除（DBS）每30秒进行一次，高灵敏度模式设置为70,000分辨率。通过Compound Discoverer 3.3（CD 3.3, Thermo Fisher）初步组织高分辨率液相色谱数据，然后针对mzCloud进行数据库搜索。

2.2 实验设计、饮食、生长性能和临床记录

总共48只断奶（30日龄）兔子用于42天的实验。每只兔子单独饲养，每个笼子代表一个重复实验单元。在评估初始体重（BW）后，将断奶兔子随机分配到四个饮食组（每组n=12），TCBR添加至其饮食中如下：（1）Mock组不含TCBR，（2）TCBR2组含2% TCBR，（3）TCBR4组含4% TCBR，和（4）TCBR6组含6% TCBR。基础饮食包含玉米和豆粕，配方满足或超过生长兔的营养需求。基本饮食的成分和近似组成见表1。实验期间兔子自由采食和饮水，未进行任何疫苗接种。每日记录个体采食量，每5天记录一次体重。计算每日采食量、体重增重和饲料转化率（FCR=采食量/体重增重）。临床评分基于Vesikari评分系统稍作修改。使用1至5的五点量表，反映正常（0分）、不采食（1分）、轻度腹泻（2分）、严重腹泻（3分）和死亡（5分）。

2.3 样品收集和屠宰性能计算

饲喂42天后，兔子在采样和屠宰前禁食一夜。每组随机选择8只兔子，通过耳缘静脉注射空气处死。通过心脏穿刺收集血样，离心收集血清，并储存于-20°C供进一步分析。每组选择8只兔子评估屠宰性能。依次进行剥皮、去肢、去头和去内脏。记录以下测量值：胴体重、半净膛重和全净膛重。根据先前研究并稍作修订，计算相对于活体重的胴体性状。

2.4 血清生化测量

使用ELISA试剂盒（F006-1-1, A110-1-1, A111-1-1, A028-2-1, C009-2-1, C013-2-1, A059-2-2, 和 A045-2-2；南京建成生物工程研究所，中国南京）和酶标仪（Tecan Austria GmbH, Vienna, Austrian）测定血清中葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）、白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血尿素氮（BUN）、碱性磷酸酶（ALP）和总蛋白（TP）的水平。

2.5 抗氧化参数测定

使用先前描述的方法测量血清和肝脏抗氧化参数。简要来说，直接分析血清样品，而肝脏样品用预冷磷酸盐缓冲盐水（1:10, v/v）匀浆，并离心（8,000 rpm，4°C，10分钟）获得澄清匀浆。使用ELISA试剂盒（A001-3-2, A007-1-1, A005-1-2, 和 A003-1-1；南京建成生物工程研究所）和分光光度计测定总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，以及丙二醛（MDA）的浓度。

2.6 回肠壁形态学观察

固定的回肠样品脱水，包埋在过热石蜡中，并切成4μm厚切片（RM2235, Leica Microsystems, Germany）。干燥、脱蜡和苏木精-伊红染色后，使用Pannoramic Scanner（C13210-01, HAMAMATSU, Japan）扫描切片。使用ImageJ软件（版本1.54）测量绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度（V/C）比值。

2.7 RNA提取、cDNA合成和定量实时PCR

根据先前研究的方法提取组织RNA。回肠组织用预冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）匀浆，匀浆液使用RNA isolator total RNA提取试剂（Vazyme Biotech, Nanjing, China）裂解。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）测量RNA浓度。随后，使用HiScript?II Q RT SuperMix for quantitative PCR（qPCR; +gDNA wiper; Vazyme Biotech）从1,000 ng RNA合成cDNA模板。使用ChamQTM SYBR? qPCR Master Mix（Vazyme Biotech）在ABI系统（Thermo Fisher Scientific）上进行实时qPCR。PCR条件包括40个循环的95°C 5秒、60°C 30秒和72°C 60秒。所用引物的序列列于表2。使用2???Ct方法计算基因相对表达。

2.8 盲肠微生物群落分析

使用CTAB法根据制造商说明从盲肠样品中提取总DNA。使用通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）扩增来自V3–V4高变区的16S rRNA基因序列。通过2%琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物，使用AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA）纯化，并使用Qubit（Invitrogen, CA, USA）定量。制备扩增子池用于测序，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, USA）和Illumina文库定量试剂盒（Kapa Biosciences, MA, USA）分别评估扩增子文库的大小和数量。在NovaSeq PE250平台上对文库进行测序。使用FLASH合并配对末端读段，过滤并复制以获得特征表和特征序列。通过随机归一化至相同序列计算Alpha和Beta多样性。使用SILVA数据库（版本138）基于相对样品丰度归一化特征丰度。使用BLAST进行序列比对，并使用SILVA数据库对每个代表性序列进行特征序列注释。

2.9 统计分析

使用SPSS软件（版本16.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行统计分析。在进行单向方差分析（ANOVA）之前，对每个数据集组应用Shapiro-Wilk正态性检验和Levene方差齐性检验。如果数据符合正态分布且具有方差齐性，则采用标准ANOVA程序。当ANOVA显示组间存在统计学显著差异时，随后使用Tukey’s Honestly Significant Difference（HSD）检验进行事后多重比较。p<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 TCBR主要成分分析

为评估TCBR作为功能性饲料的潜力，本研究采用UPLC技术鉴定TCBR的成分（图1A,B）。结果显示，TCBR中前10种主要活性成分是Vitexin、Naltrexone、Citric Acid、Ethylmorphine、Azelaic Acid、Phenibut、Kuromanin、Esculetin和Ethamivan（表3）。

3.2 临床记录、生长性能和屠宰性能

为研究TCBR是否对断奶兔产生积极影响，我们记录了断奶兔的临床症状、生长性能和屠宰性能。与Mock组相比，TCBR2显著增加了兔子的体重（13.4%）（p<0.05）。然而，TCBR4和TCBR6组未显示显著差异（图2A）。TCBR2还提高了兔子的存活率并减少了其不良临床表现（腹泻和死亡；图2B,C）。Mock组的腹泻指数最高（图2B），而TCBR6组的死亡率最高（33.3%）（图2C）。与Mock组相比，TCBR2增加了37至72日龄兔子的体重、平均日增重和FCR（p<0.05；表4）。然而，TCBR4和TCBR6未显示显著益处。与Mock组相比，TCBR2显著增加了胴体产量和半净膛产量，分别提高了3.1%和4.1%（p<0.05；表4）。TCBR4和TCBR6组之间的胴体产量和半净膛产量未观察到显著差异（p>0.05）。

3.3 血清生化

为评估TCBR的毒性，分析了兔子血清的生化指标。不同水平的TCBR补充降低了72日龄兔子的血清葡萄糖水平（表5）。与Mock处理相比，TCBR2和TCBR4降低了血清中ALP和ALT的活性以及血尿素氮浓度。TCBR2还增加了总蛋白水平 compared with the Mock treatment。此外，TCBR6显著增加了血清总胆固醇浓度（p<0.05）。

3.4 抗氧化能力

由于低剂量TCBR的干预改善了兔子的临床表现，我们假设TCBR可能具有抗氧化作用。TCBR4和TCBR6显著增加了血清中的CAT活性（p<0.05；表6）。然而，处理间血清SOD、GSH-Px和MDA活性未观察到显著差异。在肝脏中，不同水平的TCBR补充增加了SOD活性，TCBR6还增强了GSH-Px活性。但TCBR2和TCBR4降低了肝脏中MDA的浓度。然而，TCBR补充对肝脏中的CAT活性没有影响。

3.5 空肠形态

测试兔的空肠形态如图3所示。与Mock兔子相比，补充TCBR2的兔子显示绒毛高度和V/C比值显著增加（p<0.001；图3A）。然而，与Mock处理相比，补充TCBR4和TCBR6在绒毛高度或V/C比值方面未发现显著差异（p>0.05）。苏木精-伊红染色的空肠切片如图3B所示。

3.6 基因表达

TCBR补充对兔子空肠组织中基因转录水平的影响如图4所示。与Mock处理相比，TCBR2补充显著上调了occludin和ZO-1的表达水平，但对claudin-1表达没有显著影响。相反，TCBR4和TCBR6补充下调了空肠组织中occludin、ZO-1和claudin-1的表达水平。此外，TCBR2和TCBR4补充显著下调了TNF-α和IL-8的相对表达水平（p<0.05）。

3.7 盲肠微生物群分析

在本研究中，通过测序获得了8,081个ASV，随着TCBR浓度的增加，操作分类单元的数量减少（图5）。ASV Venn分析在Mock、TCBR2、TCBR4和TCBR6组中分别识别出2,174、2,169、1948和451个独特ASV（图5A）。与Mock组相比，TCBR6组的ACE和Chao1指数均降低（p<0.05）。所有TCBR处理组的Shannon和Simpson指数均低于Mock组（p<0.05）。此外，所有样品的goods_coverage指数均高于0.98。这表明样品中物种覆盖率高，测序深度合理。主坐标分析表明，随着膳食TCBR水平的增加，微生物群落逐渐发生变化（图5C）。TCBR2和TCBR4补充降低了盲肠Firmicutes门的相对丰度，同时增加了盲肠Bacteroidota门的相对丰度（p<0.0001；图6）。TCBR2还增加了盲肠Verrucomicrobiota门的相对丰度（p<0.0001）。所有TCBR水平均增加了盲肠Akkermansia属的相对丰度（p<0.001）。TCBR2进一步增加了盲肠Clostridium、Alistipes和Succiniclasticum属的相对丰度（p<0.05），而TCBR4降低了盲肠Clostridium属的相对丰度（p<0.05）。我们进行LefSe分析以阐明Mock和TCBR处理组之间微生物丰度的差异。如图7A,B所示，总共42个分支类群显示丰度存在显著差异（LDA Score>4；p<0.05）。其中，10个分支类群在Mock组中被评估为受到显著影响，包括o_clostridiales、f_lachnospiraceae、o_firmicutes等。随后，TCBR2组显示对10个分支类群有显著影响，包括c_verrucomicrobiae、f_akkermansiaceae、g_paludicola等。但13个分支类群在TCBR4组中显示受到显著影响，包括f_oscillospiraceae、p_firmicutes、c_clostridia等。此外，TCBR6组证明对9个分支类群有实质性影响，包括f_ruminococcaceae、g_muribaculaceae、o_bacteroidales等。

4 讨论

兔子因其生命周期短、妊娠期短、繁殖率高和饲料转化效率高而被认为是理想的肉用动物。作为肉类蛋白质的重要来源，养兔业受到越来越多的关注。然而，断奶兔的肠道健康对兔子生长至关重要，随着畜牧业减少抗生素使用的日益重视，对养兔业可持续健康发展的要求更高。先前的研究表明，中华红豆杉（Taxus chinensis Rehder）果实提取物（TCFE）通过减少小胶质细胞激活、降低氧化应激和影响炎症通路，显示出显著的抗衰老特性。同时，大花美人蕉（Canna x generalis）提取物（CGE）改善了肠粘膜屏障的完整性，减轻了氧化应激和炎症。这表明传统中药在促进动物健康和提高生产效率方面发挥作用。它们的副产品，即提取草药活性成分后留下的残渣，可能仍含有对牲畜有益的活性化合物。然而，TCBR作为断奶兔饲料添加剂的具体作用尚待阐明。先前的研究表明，添加姜黄残渣提高了暴露于高温环境的中华鳖的存活率。何等人发现，在热应激新西兰兔的饮食中补充生血宝草药残渣增加了体重。类似地，我们的研究发现，添加2% TCBR显著增加了断奶兔的最终体重，减少了不良临床症状，并提高了存活率。TCBR2还显著提高了兔子的平均日增重。这些效应可能与TCBR中存在的生物活性物质（如类黄酮、有机酸和生物碱）有关。然而，高剂量的金莲花残渣（兔子饮食中的6%）显示出不良临床综合征，表明较高剂量下可能存在毒性。研究发现，黄酮类化合物在450μM细胞活力下造成细胞损伤，导致分离的豚鼠肠细胞活力降低12-60%，乳酸脱氢酶（LDH）泄漏增加28-41%。此外，来自金樱子（Rosa laevigata Michx）果实的总黄酮（TFs）在2000 mg/kg/天的剂量下对雄性和雌性均可能引起副作用，如心肌细胞间隙增加和相对心脏重量增加。此外，乌头碱（Aconitine）作为传统中药的一种成分，在高剂量下显示诱导心脏毒性和神经毒性，导致神经元细胞破坏。同时，过度接触雷公藤（Tripterygium hypoglaucum）和杨梅渣多酚（MRPP）与肝细胞和肠道损伤有关。此外，源自福氏泽兰（Eupatorium fortunei）的吡咯里西啶生物碱（PAs）在25 mg/(kg·天)的剂量下，通过破坏甘油磷脂代谢，在小鼠模型中引起显著的肝毒性。因此，我们的研究为TCBR作为饲料添加剂的使用提供了实验基础，其实际应用需要更大规模样本的进一步验证。屠宰率是生长和性能的关键指标。先前的研究发现，补充中药显著提高了肉鸡的屠宰率和 evisceration 率。类似地，在松辽黑猪的饮食中补充杜仲（Eucommia ulmoides）多糖改善了生长和胴体性能。此外，在育肥猪的膳食中补充山鸡椒（Litsea cubeba）精油（LCO）和益智（Alpinia oxyphylla）精油（AEO）改善了生长性能以及营养物质的消化和吸收效率。在我们的研究中，TCBR2补充显著提高了兔子的胴体和半净膛产量，与先前的研究结果一致。血液生化标志物，如糖、脂肪和蛋白质，提供了对动物生长、营养消化、吸收和代谢的洞察。例如，白蛋白、总蛋白和尿素氮水平反映了蛋白质和氨基酸的利用和代谢，而血糖水平表明动物的葡萄糖调节和整体健康，甘油三酯和总胆固醇水平暗示脂肪代谢的效率。我们的研究显示，TCBR2补充显著增加了血清总蛋白水平，同时降低了尿素氮和甘油三酯水平。此外，TCBR补充降低了血清葡萄糖水平。中药通心络显著降低了兔子的脂质水平。然而，一些研究表明，在海兰褐蛋鸡的产蛋后期，补充女贞子（Ligustrum lucidum）对葡萄糖、总蛋白或白蛋白水平没有显著影响，这可能归因于动物物种和草药的差异。宿主代谢受肠道微生物组调节。肠道微生物组合成的短链脂肪酸、支链氨基酸和胆汁酸是宿主细胞的直接能源，也影响其宿主的能量代谢。先前的研究表明，马齿苋（Portulaca oleracea）增加了湖羊肠道菌群中的代谢色氨酸和一些维生素，从而促进肠道健康和生长性能。魏等人还证明，给奶牛补充低粗蛋白（CP）和瘤胃保护赖氨酸（RPL）平衡了氨基酸供应，提高了氮利用效率，并改变了肠道菌群组成，这有利于奶牛的泌乳性能。ALT和ALP是肝脏代谢的细胞因子和肝损伤的重要指标。研究人员表明，葛根芩连汤（GQD）通过纠正肠道菌群失调和调节胆汁酸（BA）谱，在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）小鼠模型中减轻了肝损伤和代谢紊乱。兔子补充TCBR2降低了血清ALT和ALP水平，但显著增加了肝脏SOD活性；然而，它对GSH-Px和过氧化氢酶水平没有显著影响。先前的研究表明，补充冬青（Ilicis Chinensis folium）提取物显著降低了肉鸡的ALT水平并增加了SOD活性。类似地，五味子（Schisandra chinensis）的酸性多糖在肝损伤情况下显著降低了ALT水平并增加了SOD活性。此外，研究人员证实，羟基红花黄色素A（HSYA）主要通过影响血管功能治疗创伤性脑损伤（TBI）小鼠，增加了脑微血管密度和血管生成标志蛋白VEGFA和CD34的表达。此外，七味铁屑丸（QWTX）在小鼠模型中有效减弱了对乙酰氨基酚（APAP）过量引起的血清AST、ALT和炎症因子的升高。此外，补充4%和6% TCBR显著增加了血清CAT水平。这些结果表明TCBR可能具有抗氧化特性。作为营养吸收的关键器官，肠道通过其结构、粘膜屏障和微生物组成在维持整体健康方面发挥关键作用。我们假设TCBR中的成分可以调节肠道菌群并修改肠道指数。先前的研究表明，各种化合物，如广藿香醇、木犀草素和其他治疗剂，可以调节肠道菌群并减少肠道炎症和损伤。我们的研究结果表明，与Mock处理相比，TCBR2补充显著增加了空肠绒毛高度并减少了隐窝深度。由微生物、机械和化学组分组成的肠道屏障在防止有害物质进入血液和维持体内稳定方面发挥关键作用。我们研究中的TCBR2补充显著上调了occludin-1和ZO-1的相对表达，同时下调了TNF-α和IL-8的相对表达。紧密连接蛋白occludin和ZO-1对于维持肠粘膜的完整性至关重要。改良葛根芩连汤已显示通过上调occludin和ZO-1表达改善溃疡性结肠炎模型小鼠的症状和病理损伤。桑椹提取物被发现减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠损伤和炎症，抑制结肠氧化应激，并恢复肠道紧密连接蛋白表达。我们的研究显示，TCBR2补充显著增加了Bacteroidetes和Verrucomicrobiota门的相对丰度，特别是Akkermansia属。Bacteroidetes是动物肠道微生物组中的一个突出细菌群，通过促进食物消化和营养吸收显著影响宿主生长。这些细菌通过提供对抗病原体的保护和支持其他肠道微生物而作为肠道共生体。研究人员证明，用Mycobacterium anthropophilum spp.及其代