光控CD28共刺激受体实现非基因工程人类T细胞的可逆精准激活

本研究开发了一种创新的光遗传学工具opto-CD28-REACT，通过红光（630 nm）和远红光（780 nm）照射可逆调控非基因修饰人类T细胞的CD28共刺激信号，并与T细胞受体（TCR）信号形成协同效应，为免疫细胞精准调控提供了新技术平台。

　　

1 引言

T细胞通过T细胞受体（TCR）识别抗原呈递细胞（APC）呈递的抗原，进而激活、增殖并分化为效应细胞执行免疫功能。然而，单纯的TCR信号不足以激活初始T细胞，反而可能导致T细胞无能（anergy）。完全激活需要共刺激信号，其中CD28共受体与B7配体的结合是关键环节。CD28几乎在所有CD4⁺T细胞和大部分CD8⁺T细胞表面组成性表达，其分子密度（约60,000/细胞）显著高于TCR（约20,000/细胞）。CD28共刺激通过调节细胞周期进程、减少细胞死亡或凋亡来防止无能状态，并降低TCR激活阈值，使少量抗原配体即可有效激活T细胞。

体内研究表明，初始T细胞在迁移过程中被激活。在淋巴结中，T细胞首先与抗原负载的APC形成短暂的连续接触，随后建立稳定接触，最终脱离并开始增殖。在此过程中，TCR和CD28被刺激并启动信号传导，但脱离后信号迅速逆转，原因可能是配体-受体相互作用的丧失。目前，配体结合动力学的时空模式如何影响T细胞激活和分化尚不明确，部分原因是缺乏测定体外配体结合动力学的技术。

光遗传学技术利用光响应蛋白（如植物光受体）以高时空精度操纵配体-受体相互作用，为研究配体结合动力学对T细胞激活行为的影响提供了有力工具。其中，光敏色素B（PhyB）及其相互作用因子（PIF）分别与细胞配体和受体融合，可实现受体激活的时空控制。在TCR研究中，PhyB-PIF系统已用于红光依赖的TCR簇集和激活控制。此外，细胞外光遗传学技术将这些能力扩展到非基因修饰细胞。例如，光诱导T细胞接合剂（LiTE）和光遗传受体激活（opto-REACT）通过将PIF与靶向CD3的单链可变片段（scFv）耦合，在红光照射下引发TCR簇集和信号激活，远红光照射则可在数秒内终止该相互作用。为区分，本研究将靶向TCR的opto-REACT称为opto-CD3?-REACT。

本研究旨在开发opto-CD28-REACT工具，用于完全激活非基因修饰的原代人类T细胞，并展示其与opto-CD3?-REACT联合使用时可实现光控共刺激，为剖析TCR和CD28在T细胞激活中的角色提供新方法。

2 结果

2.1 重组opto-CD28-REACT与CD28阳性细胞结合

为实现非基因修饰人类T细胞的光控共刺激，研究团队开发了重组工程蛋白opto-CD28-REACT。该蛋白由抗人CD28抗体CD28.3衍生的scFv、单体绿色荧光蛋白（moxGFP，简称GFP）、phytochrome-interacting factor 6（PIF6）的前100个氨基酸（含C9S和C10S突变）以及His6标签组成，分子量为67 kDa。该设计类似于先前靶向TCR的opto-CD3?-REACT。

蛋白在大肠杆菌中表达后，通过Ni²⁺亲和层析和尺寸排阻色谱纯化，获得单体形式。SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western blot（使用抗His和抗GFP抗体）验证了纯化成功，并观察到较低分子量的条带（可能为scFv-GFP和PIF6-His蛋白）。流式细胞术显示，opto-CD28-REACT与人CD28表达的Jurkat细胞系结合，但不与人CD28阴性的Nalm6 B细胞系或小鼠2B4 T细胞系结合，证实了其结合特异性。竞争实验进一步表明，随着抗CD28抗体浓度增加，opto-CD28-REACT的GFP中位荧光强度（MFI）降低，验证了特异性结合。剂量反应结合分析进一步表征了opto-CD28-REACT与Jurkat细胞的结合特性。

2.2 Opto-CD28-REACT以可逆光依赖方式刺激共受体CD28

光遗传共受体激活基于PhyB与PIF6的光依赖相互作用。在本系统中，CD28结合的opto-CD28-REACT的PIF6在红光（630 nm）照射下与链霉亲和素包被的珠子上的PhyB四聚体结合，触发CD28簇集和下游信号通路激活；远红光（780 nm）照射则导致PhyB-PIF6解离，终止CD28簇集。

为测试opto-CD28-REACT功能，Jurkat T细胞加载该试剂后，与PhyB耦合珠子共培养24小时，并通过流式细胞术分析CD25和CD69表达。红光照射略微上调CD25和CD69，而远红光无此效应。浓度递增的opto-CD28-REACT（5至100 nM）在红光照射下引起浓度依赖的CD25和CD69表达增加，表明光依赖的CD28共刺激成功实现。

为测试CD28与TCR的协同作用，研究同时用抗CD3抗体和opto-CD28-REACT刺激细胞。抗CD3单独刺激可上调CD25和CD69表达，而联合opto-CD28-REACT和红光照射进一步增强了这种上调。在IL-2分泌方面，只有抗CD3和opto-CD28-REACT联合红光照射才引起显著浓度依赖的IL-2分泌增加，且产量高于单独刺激之和，证实了协同效应。

为测试刺激可逆性，Jurkat细胞加载opto-CD28-REACT后，先以红光照射不同时长，再以远红光照射至24小时结束。在整个实验中，所有细胞均通过低浓度抗CD3抗体同时刺激TCR。随着远红光照射时间延长，CD25表达和IL-2分泌逐渐下降，表明opto-CD28-REACT可实现可逆的CD28激活控制。

为考察CD28信号关闭速度，研究评估了配体脱离后ERK磷酸化动力学。加载opto-CD28-REACT的Jurkat T细胞与光遗传APC（表达PhyB的HEK293细胞）共培养，并通过低浓度抗CD3抗体刺激TCR。细胞先以红光照射8分钟，然后通过远红光终止配体结合。配体脱离1分钟后，磷酸化ERK阳性细胞显著减少；2分钟后，降至未刺激CD28的水平，表明CD28信号在2分钟内即可关闭。

2.3 光遗传共刺激TCR和CD28增强T细胞应答

为测试两种opto-REACTs在调控T细胞激活中的联合效应，研究同时使用opto-CD28-REACT和opto-CD3?-REACT，通过PhyB耦合珠子实现CD28和TCR的同步光依赖簇集。Jurkat T细胞用两种opto-REACTs处理，并与PhyB耦合珠子共培养24小时。远红光照射下，T细胞未上调CD69或CD25；而红光照射下，细胞显著上调CD25和CD69表达，表明通过CD28和TCR的光遗传共刺激成功。

滴定实验显示，随着opto-CD28-REACT浓度增加（10、30、50 nM），在红光照射下，CD25和CD69表达以及IL-2分泌呈浓度依赖性增加，而远红光无此效应。较高浓度opto-CD3?-REACT（25 nM）未比低浓度（5 nM）产生更强反应，且30 nM与50 nM opto-CD28-REACT无差异。因此，后续实验采用5 nM opto-CD3?-REACT和30 nM opto-CD28-REACT。这些结果突显了两种opto-REACTs联合使用作为光控TCR和CD28受体激活的稳健可调平台。

2.4 光遗传刺激TCR和CD28导致原代人类T细胞的光依赖激活

在验证Jurkat细胞可通过opto-CD3?-REACT和opto-CD28-REACT光遗传激活后，研究测试了这些试剂激活原代人类T细胞的能力。通过Ficoll密度梯度离心从健康供体分离外周血人类T细胞，与opto-REACTs孵育使其结合特定受体，无需基因修饰。光遗传激活通过将细胞与PhyB耦合珠子共培养3天，并施以630 nm或780 nm光照实现。

24和48小时后，在两种opto-REACTs联合630 nm光照下，CD8⁺和CD8^?T细胞的CD25和CD69表达均上调，而780 nm光照无此效应。光遗传刺激程度与传统抗CD3和抗CD28抗体刺激相似。单独光遗传刺激CD28仅引起最小程度上调，而单独TCR刺激引起中度上调；但两种opto-REACTs共刺激显示协同响应，表明尽管两者结合相同PhyB配体，但仍可组合产生有效激活。

协同效应在诱导CD8⁺T细胞增殖方面尤为明显。刺激48和72小时后，细胞增殖染料CellTrace Violet（CTV）稀释显示显著增殖，与细胞大小增加（通过前向散射和侧向散射值检测）和活细胞百分比增加一致。CD8^?细胞也呈现类似趋势，且刺激条件未影响CD8⁺和CD8^?比例。

为评估功能激活，研究通过ELISA定量了刺激T细胞（包括CD8⁺和CD8^?细胞）培养上清中IL-2和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌量。如预期，观察到光依赖的细胞因子分泌：仅当细胞用两种opto-REACTs处理并施以630 nm光照时，24小时后检测到IL-2，随后随时间下降；IFN-γ分泌在CD28和TCR联合刺激下出现，且单独opto-CD3?-REACT也有较弱效应，从24小时开始并随时间增加。抗体对照的低细胞因子分泌可能由实验设置解释（光遗传刺激中PhyB负载于珠子，而抗体包被于塑料板）。总之，这些结果证实原代人类T细胞可通过opto-CD3?-REACT和opto-CD28-REACT联合实现最佳协同激活。

2.5 延长刺激期间补充额外opto-REACTs和PhyB耦合珠子不增强细胞激活但降低存活率

由于PhyB活性对氧化敏感，且opto-REACT试剂可能随时间被T细胞消耗，这可能影响长时间刺激（如72小时）。为此，研究测试了在24或48小时后添加额外opto-REACTs和新鲜PhyB耦合珠子是否能增强原代人类T细胞刺激（分析设定在72小时）。

在CD8⁺和CD8^?细胞中，添加PhyB导致CD25⁺细胞百分比和细胞大小略有增加，但CD69⁺细胞百分比无变化（CD8^?细胞中甚至略有减少）。两种细胞类型在添加刺激物后增殖减弱，总细胞数也下降。这些数据表明，添加额外opto-REACTs和PhyB耦合珠子可能导致过度刺激和细胞死亡增加。因此，不建议在刺激1或2天后添加额外opto-REACTs或PhyB耦合珠子。

3 讨论

本研究介绍了opto-CD28-REACT作为一种创新光遗传工具，用于可逆可调地共刺激非基因修饰人类T细胞的CD28。该途径利用光控CD28簇集诱导T细胞激活必需的CD28信号通路。先前研究展示了光遗传控制TCR信号的优势，本研究将该原理扩展到共受体CD28。

研究表明，opto-CD28-REACT特异性结合人CD28，从而允许PhyB四聚体光依赖刺激CD28。刺激通过CD28信号的下游读出显示，无论是CD28单独刺激还是与TCR联合（使用抗CD3抗体或opto-CD3?-REACT）。CD28单独刺激在opto-CD28-REACT和抗CD28抗体条件下显得非常弱，这由共刺激特性解释：CD28增强TCR信号，但自身效应微弱。以光依赖方式触发和终止CD28信号的能力实现了精确的时间控制（如本研究所示）和潜在空间控制，具有优异分辨率。

无需基因修饰控制受体激活（如使用opto-CD28-REACT）具有优势，可在不需要永久改变基因组的情况下实现免疫细胞活性的精确可逆调控。

结果强化了CD28在调制TCR信号中的基本作用。CD28共刺激增强TCR介导的应答，增加IL-2产生和增殖。确实，观察到opto-CD28-REACT与抗CD3或opto-CD3?-REACT联合刺激比单独TCR刺激更强地上调CD69和CD25。在评估IL-2和IFN-γ分泌时也观察到类似协同效应，突显了共刺激信号对最佳T细胞激活的必要性。此外，这表明两种opto-REACTs竞争结合珠子上PhyB分子并不妨碍同时刺激两种受体。数据表明存在饱和阈值，超过该阈值增加opto-CD3?-REACT或opto-CD28-REACT浓度不再增强激活，可能是由于受体结合饱和，或与先前研究一致，表明最佳T细胞激活依赖于平衡的受体参与而非过度刺激。

光遗传工具通过交替630 nm和780 nm波长实现可逆性，使T细胞激活的时间调制成为可能，将光遗传系统与缺乏此类可逆性的传统抗体方法区分开来。这一进展使研究受体刺激动力学（本例中为CD28刺激）如何影响细胞响应成为可能。实际上，研究T细胞激活动力学是一个新兴研究主题。

此外，研究显示CD28共刺激对TCR介导的激活事件（如激活标志物上调、细胞因子分泌或增殖）的效应在CD8⁺T细胞（细胞毒性T细胞）和CD8^?T细胞（主要是CD4⁺辅助T细胞）中非常相似。进一步研究可探索opto-CD28-REACT刺激在不同T细胞亚群（包括调节性T细胞或γδ T细胞，它们具有不同的共刺激需求）中的效应。

总之，本研究提出了一种新颖、可逆、可调的光遗传系统用于CD28介导的T细胞共刺激，证明了其与TCR信号的功能协同。opto-CD3?-REACT方法成功应用于设计opto-CD28-REACT，表明该原理可能也适用于其他受体——无论是在免疫学还是生物学或医学的其他领域。将该方法扩展到其他刺激、共刺激或抑制性受体可能提供强大工具，以深入理解细胞如何解读细胞外信号来控制其激活、分化或发育过程。

4 方法

4.1 分子克隆

靶向人CD28的scFv基于Vanhove等人报道的序列设计。合成DNA片段（密码子优化用于大肠杆菌表达）订购自Integrated DNA Technologies（IDT）。优化scFv28.3序列与单体抗氧化绿色荧光蛋白（moxGFP）和PIF6前100个氨基酸融合。构建体通过限制酶切和连接组装到表达载体（pMH71/pRSET）中。所有克隆步骤通过DNA测序验证最终构建体准确性。

4.2 蛋白质生产与纯化

Opto-CD28-REACT和opto-CD3?-REACT：蛋白在SHuffle T7 Express大肠杆菌（NEB）中表达，0.2 mM IPTG诱导后18°C过夜。细胞通过超声裂解，蛋白通过序贯色谱步骤纯化，包括Ni亲和、阴离子交换和凝胶过滤色谱。Ni亲和纯化使用HisTrap FF 5-mL柱，缓冲液A（50 mM Tris, 800 mM NaCl, 20 mM咪唑, 10%甘油, pH 8.0）平衡，结合蛋白用60%缓冲液B（50 mM Tris, 300 mM NaCl, 400 mM咪唑, 10%甘油, pH 8.0）洗脱。阴离子交换色谱使用MonoQ 5/50 GL柱，缓冲液A（50 mM Tris, pH 8.5）平衡，缓冲液B（50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0）线性梯度洗脱。最终通过凝胶过滤色谱（Superdex 200 10/300柱，PBS平衡）纯化。

Phytochrome B：生物素化形式PhyB在大肠杆菌中从质粒pMH1105产生，通过IMAC纯化。该质粒编码血红素氧合酶1（HO1）和PCB：铁氧还蛋白氧化还原酶（PcyA），负责生色团藻蓝胆素（PCB）的生物合成。

4.3 蛋白质表征

SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色：蛋白纯度通过10%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE评估。样品在Laemmli缓冲液中95°C煮沸5分钟，与分子量标记一起分离，考马斯亮蓝R-250染色可视化蛋白条带。

Western blot：SDS-PAGE后，分离蛋白通过半干转印（18 V, 50分钟）转移到PVDF膜。膜在洗涤缓冲液（PBS, 0.1% Tween 20）加5%奶粉中封闭，洗涤三次。一抗抗GFP（1:1,000）和抗His（1:5,000）在洗涤缓冲液加3% BSA和0.02% NaN₃中4°C过夜孵育。洗涤后，膜与HRPO偶联抗山羊抗体（1:5,000）或HRPO偶联抗链霉亲和素抗体（1:2,000）室温孵育45分钟。蛋白通过ECL Prime Western Blotting Detection Reagent化学发光检测。

4.4 细胞培养

Jurkat E6.1细胞在RPMI-1640培养基（补充10% FBS, 100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素, 10 mM HEPES，称为完全培养基）中，37°C、5% CO₂湿润气氛维持。

原代人类T细胞从健康人供体血（伦理批准号22-1275-S1）通过密度梯度离心（Pancoll与血液比例1:2.5，血液PBS加2 mM EDTA稀释1:2）分离，随后用ACK缓冲液（150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA）裂解红细胞。此阶段获得的外周血单个核细胞（PBMC）用于刺激，在与Jurkat E6.1细胞相同条件和培养基中孵育。

4.5 Opto-CD28-REACT与不同细胞类型结合

1×10⁵人T细胞（Jurkat）、小鼠T细胞（2B4）或人B细胞（Nalm6）与100 nM opto-CD28-REACT在37°C、5% CO₂中孵育30分钟。对照细胞与1:200稀释生物素偶联CD28抗体在冰上孵育15分钟，随后与APC偶联链霉亲和素二次染色。洗涤后，细胞重悬于染色缓冲液（PBS + 1% FBS），Attune NxT流式细胞仪分析。GFP和APC偶联物分别用488 nm和637 nm激光激发，530/30 nm和670/14 nm发射滤光片检测。

4.6 Opto-CD28-REACT与抗CD28抗体结合竞争

每条件1×10⁵ Jurkat T细胞与100 nM opto-CD28-REACT和不同浓度抗CD28抗体或非竞争抗体（抗HA标签）在冰上孵育30分钟。孵育后，细胞重悬于染色缓冲液，Attune NxT流式细胞仪分析。GFP用488 nm激光激发，530/30 nm发射滤光片检测。

4.7 PhyB耦合珠子

所有涉及PhyB步骤在绿光条件下进行以防止提前激活。链霉亲和素包被珠子（Spherotec）悬浮液涡旋确保均匀。部分珠子溶液转移至反应管，与含1.5 mM TCEP的PBS 1:1稀释。混合物4°C, 15,000 × g离心10分钟，小心弃上清。重复洗涤。对于PhyB包被，珠子与60 μg/mL PhyB在含1.5 mM TCEP的PBS中（1×10⁶珠子于50 μL）冰上黑暗孵育1小时。洗涤后，珠子重悬于无生物素RPMI-1640完全培养基，浓度1×10⁵珠子/50或100 μL。初始刺激时，每孔加1×10⁵珠子，板用740 nm光照射1分钟以灭活PhyB包被珠子。详细方案见参考文献。

4.8 Jurkat T细胞的光依赖激活

Jurkat T细胞实验前一天1:2传代。为准备光遗传刺激，指定量opto-CD3?-REACT和/或opto-CD28-REACT加入1×10⁶细胞/mL无生物素RPMI-1640完全培养基。抗体刺激时，分别加1 μg/mL可溶性抗CD3（UCHT1）和/或抗CD28。每孔终体积225 μL于黑色96孔透明底板。刺激在37°C、5% CO₂中进行24小时。之后，上清-20°C冷冻，细胞与AF647偶联CD69抗体和PE偶联抗CD25抗体（1:200于染色缓冲液）冰上染色15分钟。洗涤后，细胞重悬于染色缓冲液，Attune NxT流式细胞仪分析。GFP、PE和AF647偶联物分别用488 nm、561 nm和637 nm激光激发，530/30 nm、585/16 nm和670/14 nm发射滤光片检测。数据使用补充图所示设门策略分析。

4.9 Jurkat T细胞光遗传激活后细胞内磷酸化ERK染色

5×10⁴光遗传APC在100 μL RPMI-1640培养基（补充1% FBS, 100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素, 10 mM HEPES）中种子黑色96孔透明底板一孔，37°C、5% CO₂过夜孵育。Opto-CD28-REACT（30 nM）加入1×10⁶ Jurkat细胞/mL无FBS RPMI-1640培养基，37°C、5% CO₂孵育1小时。同时，从光遗传APC移除培养基，每孔加50 μL含10 μg/mL PhyB-mCherry-SpyTag的无FBS RPMI-1640培养基，37°C、5% CO₂孵育30分钟。移除多余PhyB-mCherry-SpyTag溶液后，加50 μL含opto-CD28-REACT的T细胞。此外，细胞加终浓度50 ng/mL可溶性抗CD3（UCHT1）。每孔终体积100 μL。刺激在37°C、5% CO₂中进行最多16分钟。为停止刺激，细胞转移至含150 μL 4%多聚甲醛的96V底孔，冰上孵育30分钟。之后，细胞4°C, 550 × g离心5分钟，用染色缓冲液洗涤。为透化，细胞重悬于50 μL冰冷90%甲醇，冰上孵育30分钟。洗涤后，细胞与抗磷酸化ERK抗体（1:200于染色缓冲液）4°C过夜孵育。洗涤后，细胞与二级山羊抗兔DyLight-633抗体（1:200于染色缓冲液）室温孵育2小时。洗涤后，细胞重悬于染色缓冲液，Attune NxT流式细胞仪分析。BFP、mCherry和DyLight-633偶联物分别用405 nm、561 nm和637 nm激光激发，512/15 nm、620/15 nm和670/14 nm发射滤光片检测。数据使用补充图所示设门策略分析。

4.10 原代人类T细胞的光依赖激活

1×10⁶ PBMCs/mL于无生物素RPMI-1640培养基（补充100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素, 10 mM HEPES）与1:1,000稀释CTV孵育20分钟，37°C、5% CO₂。为去除游离染料，加无生物素FBS至终浓度10%，再孵育5分钟。洗涤后，5 nM opto-CD3?-REACT和/或30 nM opto-CD28-REACT加入1×10⁶ PBMCs/mL无生物素RPMI-1640完全培养基。细胞37°C、5% CO₂孵育30分钟。每孔种1.5×10⁵细胞于黑色96孔透明底板。对于抗体刺激，孔预先用50 μL PBS含1 μg/mL抗CD3（UCHT1）和抗CD28包被，37°C、5% CO₂孵育2小时。用于对照的PBMCs未耦合opto-REACTs。每孔刺激起始体积200 μL。24和48小时后，每孔加50 μL无生物素RPMI完全培养基。光遗传刺激在37°C、5% CO₂中进行最多72小时。之后，上清-80°C冷冻，细胞与Zombie NIR（1:500于PBS）室温黑暗染色20分钟。洗涤后，抗体染色用AF488偶联CD3抗体、AF700偶联CD8抗体、AF647偶联CD69抗体和PE偶联抗CD25抗体（1:200于染色缓冲液）冰上15分钟进行。洗涤后，细胞重悬于染色缓冲液，Attune NxT流式细胞仪分析。CTV、GFP、AF488、PE、AF647和AF700偶联物及NIR分别用405 nm、488 nm、561 nm和637 nm激光激发，440/50 nm、530/30 nm、585/16 nm、670/14 nm、720/30 nm和780/60 nm发射滤光片检测。数据使用补充图所示设门策略