细胞毒性T淋巴细胞中HLA-DR表达：提升基于T细胞的乳腺癌治疗策略潜力的关键

本综述聚焦细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）表面HLA-DR分子的表达，揭示其作为预测乳腺癌（BC）新辅助化疗（NACT）反应的生物标志物及增强抗肿瘤免疫的关键作用。研究通过体外和体内实验证实，HLA-DR+ CTLs具有更强的肿瘤细胞清除能力，并发现PD-1阻断可协同上调HLA-DR表达，为优化过继性T细胞疗法（ATC）及联合免疫治疗提供了新策略。

　　

1 引言

乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的癌症类型，每年新发病例高达200万例。其固有的异质性影响了治疗选择，通过特定生物标志物如激素受体（HR）状态和人表皮生长因子受体2（HER2）水平，BC可分为四种亚型：管腔A型（HR+/HER2?）、HER2+型（HR-/HER2+）、管腔B型（HR+/HER2+）和三阴性乳腺癌（TNBC；HR?/HER2?）。尽管手术、化疗、放疗以及近年来的免疫治疗取得了进展，但BC治疗的局限性依然存在。

新辅助化疗（NACT）是处理高风险、局部晚期或不可手术BC肿瘤的广泛接受的方法，但只有不到50%的患者能达到病理完全缓解。先前的研究提出，细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）中高水平的HLA-DR表达是预测BC患者对NACT反应的有效且独立的生物标志物。然而，对于化疗耐药肿瘤的BC患者，缺乏有效治疗选项仍是一个重大的临床挑战。

免疫疗法为癌症治疗提供了有前景的途径，但其效果因患者免疫能力和肿瘤异质性而异。免疫检查点抑制剂（ICIs）针对程序性死亡-1（PD-1）或其配体（PD-L1），现已成为晚期或转移性PD-L1阳性TNBC的标准一线治疗。此外，ICIs最近也获批用于高风险早期TNBC。目前，多项临床试验正尝试将免疫治疗扩展到所有BC亚型，尤其关注早期病例，因其肿瘤微环境免疫抑制程度较低。

CAR-T细胞疗法也作为BC的替代免疫治疗正在探索中。这种创新方法涉及改造患者的T细胞，使其表达特异性靶向癌细胞的嵌合抗原受体（CARs）。近期临床前模型显示 promising 结果，但目前尚无FDA批准的用于实体瘤（包括BC）的CAR-T细胞疗法。

过继性T细胞疗法（ATC）已成为抗癌的重要治疗策略。该策略不断演进，并通过持续临床试验作为独立治疗或与其他免疫疗法联合使用。最近一例病例表明，输注自体T淋巴细胞（经设计靶向新抗原并在体外扩增）与ICIs联合，成功治疗了一名化疗难治性转移性BC患者。

尽管ATC疗法在BC治疗中具有潜力，但其融入临床实践面临高昂成本、技术复杂性及细胞因子释放相关毒性的挑战。此外，虽然ICIs在BC中取得重大进展，但主要集中于TNBC，其他亚型选择有限。调控BC患者的免疫系统似乎是开发更个性化疗法的鼓励性策略。

基于HLA-DR表达CTLs在肿瘤微环境中协助NACT消除癌症并展现抗肿瘤特性的观点，先前建议在BC的新治疗策略中考虑增加CTLs中HLA-DR表达水平。本文进一步探讨了HLA-DR表达CTLs的治疗潜力，并报告了增强这些细胞的策略。具体而言，工作强调了CTLs中HLA-DR表达水平在监测体外操作细胞质量、开发过继性T细胞转移方案中的相关性，并证明了nivolumab（一种靶向PD-1的单克隆抗体）与CTLs体外短期刺激的协同效应，可提升其HLA-DR表达，从而增强这些细胞的细胞毒性。

这种协同作用可能与CTLs中PD-1和HLA-DR共享常见相关基因（如一些已知的基因表达调节因子）有关，如对BC单细胞RNA测序数据库的计算机分析所揭示。这种联合策略为未来整合基于T淋巴细胞的方法以放大免疫反应和实现更有利BC患者 outcomes 提供了有前景的途径。

2 方法

2.1 人类样本

本研究主要使用从32名健康 donor 的 buffy coats 中分离的免疫细胞，由葡萄牙血液和移植研究所（IPST）提供。此外，使用了来自 Hospital CUF Descobertas、Hospital CUF Tejo、Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil 和 Hospital Prof. Doutor Fernando Fonseca 的209名诊断为BC的患者样本。具体而言，使用了14名晚期/转移性疾病BC患者的血液样本和195名选择进行NACT的BC患者的活检样本。获得了所有个体的书面知情同意，并得到了医院、IPST和NOVA Medical School伦理委员会的批准。研究符合赫尔辛基宣言。

患者主要特征详见表1。患者血液样本使用含乙二胺四乙酸（EDTA, Vacutest）的Vacutainer管收集。新鲜活检样本收集在Transfix（Cytomark）中以保存细胞抗原，便于流式细胞术分析。

外周血单核细胞（PBMCs）通过Ficoll梯度（Sigma Aldrich）从全血或buffy coats中分离，并冷冻保存在含90%胎牛血清（FBS, Biowest）和10%二甲基亚砜（DMSO, Sigma Aldrich）的溶液中供后续使用。

活检样本通过BD Medicon（BD Biosciences）进行机械解离，经30 μm尼龙网（Sysmex）过滤，用1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后进行流式细胞术染色。

2.2 乳腺癌细胞系

体外实验主要使用三阴性乳腺癌（TNBC）衍生细胞系MDA-MB-231。此外，部分实验使用覆盖不同BC亚型的多种BC细胞系，即BC细胞系BT-474（HER-2+亚型）、HCC1806（TNBC亚型）、Hs578T（TNBC亚型）和MCF-7（ER+亚型）。Hs578T、MCF-7和MDA-MB-231细胞系在Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM, Gibco）中培养，补充10% FBS（Biowest）和1%青霉素/链霉素（GE Healthcare）。BT-474和HCC1806细胞系在RPMI 1640（Gibco）中培养，补充10% FBS和1%青霉素/链霉素。BT-474、Hs578T和MCF-7细胞系培养中额外使用10μg/mL胰岛素（Sigma Aldrich）。细胞在T75培养瓶中单层培养，在湿润条件（37°C, 5% CO₂）下生长直至达到80-90%汇合度。后续细胞传代通过TrypLE（Gibco）解离细胞进行。

特别是对于体内实验，Hs578T癌细胞通过慢病毒转导用TdTomato荧光标记。细胞在T175培养瓶中培养直至70-80%汇合度，并用EDTA 1 mM（在DPBS 1X中稀释）和细胞刮刀解离。

细胞系定期检测支原体污染。

2.3 流式细胞术

对于流式细胞术分析，活检、血液样本或共培养中的BC细胞-PBMCs在处理成单细胞悬液后，用一组单克隆小鼠抗人偶联抗体（mAbs）染色。对于血液样本，方案包括一个额外的红细胞裂解步骤，使用RBC裂解缓冲液（Biolegend）在黑暗中和4°C下孵育20分钟。简要而言，染色方案涉及将细胞与mAbs在室温下孵育15分钟，然后用1 mL PBS 1X洗涤并以300g离心5分钟。每当分析细胞内标记时，细胞用Fix/Perm kit（eBioscience）在室温下固定和透化30分钟。细胞内mAbs添加30分钟，随后用1 mL PBS 1X洗涤并以300g离心5分钟。

使用的mAbs包括：anti-CD45-PercP（克隆HI30）、anti-CD3-PercP（克隆HIT3a）、anti-CD3-APC（克隆UCHT1）、anti-CD25-PE（克隆BC96）、anti-CD4-FITC（克隆OKT4）、anti-CD8-PE（克隆HIT8a）、anti-CD8-PacificBlue（克隆HIT8a）、anti-HLA-DR-APC（克隆L243）、anti-Granzyme B-FITC（克隆QA16A02）、anti-CD69-PercP（克隆FN50）、anti-CD45-PercP（克隆HI30），全部来自Biolegend。细胞活力用BD Horizon? Fixable Viability Stain 450（BD Biosciences）测定，与细胞悬液在黑暗中和4°C下孵育20分钟。

数据采集使用BD荧光激活细胞分选（FACS）Canto II与FACSDiva Software v8（BD Biosciences）进行，结果使用FlowJo software v10分析。

CTLs被鉴定为CD3+CD8+事件，基于单细胞的顺序设门。CD4+ T细胞，在补充材料中呈现，被定义为CD3+CD4+细胞。代表性设门策略显示在补充图S1中。

通常，数据呈现为相对于单细胞门或CD8+细胞或CD4+细胞（在补充材料中）中给定标记阳性群体的阳性群体百分比。

2.4 荧光激活细胞分选

为去除CD4+细胞，PBMCs用anti-CD45-PercP（克隆HI30）和anti-CD4-FITC（克隆OKT4）染色。这些细胞随后被分选成两个不同群体：CD45+/CD4+和CD45+/CD4阴性。对于另一个实验，PBMCs被分选以分离CD25+/HLA-DR阴性细胞和CD25+/HLA-DR+细胞，在用anti-CD25-PE（克隆BC96）和anti-HLA-DR-APC（克隆L243）染色后。这些分选群体随后被重新整合到剩余PBMCs中。分选使用BD Biosciences的FACS Aria III系统进行，效率超过90%。

2.5 建立3D共培养

建立了BC细胞系和同种异体PBMCs以1:3比例在琼脂糖包被板上的3D共培养，如先前建立。在共培养前，PBMCs用小鼠抗人anti-CD3（5 μg/mL）、anti-CD28（1 μg/mL）和大鼠抗小鼠IgG1（5 μg/mL）作为交联抗体（Biolegend）刺激48小时。此外，白细胞介素2（IL-2）100 IU/mL和白细胞介素12（IL-12）20 ng/mL（PeproTech）在刺激方案的最后24小时添加到PBMCs单培养中。

在PBMCs与BC细胞系共培养24小时后，在一些实验（药物筛选）中，治疗性抗体被引入3D共培养。48小时后，球体从板中移除，通过 pipetting 解离，并用Fixable Viability Dye染色，通过流式细胞术评估共培养中存活癌细胞的百分比。泛白细胞标记anti-CD45（克隆HI30, Biolegend）也被用于区分肿瘤和免疫细胞。

2.6 HLA-DR+细胞毒性T淋巴细胞的扩增

PBMCs最初以1x10⁶ cells/mL密度在24孔板中播种，在1 mL RPMI 1640培养基中，补充10% FBS和1%青霉素/链霉素。对于T淋巴细胞激活和扩增，在第0天向PBMCs培养中添加5 mg/mL小鼠抗人anti-CD3、1μg/mL小鼠抗人anti-CD28和5μg/mL大鼠抗小鼠IgG1（Biolegend）。孵育24小时后，各种白细胞介素 cocktail 被添加到培养中。IL-2始终以100 IU/mL浓度使用，而IL-7、IL-12和IL-15以20 ng/mL浓度（PeproTech）使用。细胞在37°C、含5% CO₂的湿润 atmosphere 中孵育14天。为维持最佳细胞生长，每2-3天，一半培养培养基被替换为含白细胞介素的新鲜培养基。在整个孵育过程中，细胞在七个时间点（即第0、3、5、7、9、11、14天）使用台盼蓝排除染料（GE Healthcare）监测和计数。当孔汇合时，培养被分到新孔中。为评估每个条件的最终细胞数，该条件下所有孔的细胞计数在计数后求和。

对于每个条件，HLA-DR+CTLs的频率在相同时间点通过流式细胞术监测。

2.7 HLA-DR阻断 assay

HLA-DR阻断使用从健康 donor 获得的PBMCs进行，在不同实验条件下培养72小时：无刺激、有刺激、以及有刺激加上HLA-DR阻断抗体。刺激如上所述进行，对于HLA-DR阻断，使用10μg/mL纯化抗人HLA-DR（克隆L243, Biolegend）。72小时培养期后，细胞被收获并用anti-CD25（克隆BC96, Biolegend）、anti-CD69（克隆FN50, Biolegend）和anti-Granzyme B（克隆QA16A02, Biolegend）标记，以评估CTLs的激活状态。标记表达在门控CD8+ T细胞群体内特异性分析，如设门策略中所定义（补充图S2）。CD4+ T细胞的类似分析进行并在补充材料中呈现。

2.8 药物筛选

药物筛选实验使用我们建立的3D共培养平台进行。简要而言，BC细胞系BT-474、HCC1806、Hs578T、MCF-7和MDA-MB-231用如上所述处理的PBMCs挑战，加上添加以下候选药物：Nivolumab（Anti-PD-1, Bristol-Myers Squibb）、Bevacizumab（Anti-VEGF, Roche），由Champalimaud基金会提供，4-1BB（anti-137, 克隆4B4-1, Biolegend）和anti-OX40（Anti-134, 克隆Ber-ACT35, Biolegend）。

所有化合物以50 μg/mL浓度测试。化合物对癌细胞活力的影响通过流式细胞术评估，如上所述。

2.9 乳腺癌斑马鱼异种移植实验

体内实验在Champalimaud基金会进行，使用斑马鱼模型（Danio rerio）Tg(fli1:GFP)，其维持和处理符合欧洲动物福利立法和Champalimaud鱼类平台计划。胚胎在E3培养基中标准条件下维持在28.5°C，并根据受精后小时数（hpf）分期。

在48 hpf，斑马鱼幼虫用Tricaine 1X（160 mg/L）麻醉，Hs578T TdTomato细胞单独或与PBMCs以1:1比例混合，显微注射到围卵腔空间（PVS）。对于注射，PBMCs先前重悬在CellTracker^(TM) Deep Red（1:1000 from the stock, Thermo Scientific）中并在37°C孵育10分钟，随后在4°C下15分钟。

注射后，异种移植体留在胚胎培养基（E3）中于34°C。注射后24小时，成功注射的异种移植体在荧光显微镜下筛选并根据肿瘤大小分层。E3培养基每日更新，并移除死亡异种移植体。在 assay 结束时，异种移植体被牺牲并在4%（v/v）甲醛（FA）（Thermo Scientific）中于4°C固定过夜。

固定后第二天，FA被移除，异种移植体用PBS-Triton 0.1%透化。细胞核用DAPI（0.05mg/mL）在4°C下反染过夜。第二天，DAPI通过顺序洗涤用PBS-Triton 0.1%移除，异种移植体用MOWIOL封片介质封片在两个盖玻片之间。所有图像使用Zeiss LSM710荧光共聚焦显微镜获取。肿瘤大小量化如先前描述进行。

2.10 生物信息学分析

为调查涉及HLA-DR和PD1基因的潜在调控网络，我们使用来自BC患者的scRNA-seq数据，特别关注CTLs的基因表达。数据从TIGER数据库（可在http://tiger.canceromics.org/#/获取）提取，其作为它们的存储库。分析使用R version 4.4.0进行。与HLA-DR和PD1相关的基因搜索策略分为三个阶段：a) 搜索与HLA-DR基因正/负相关的基因；b) 搜索与PD1基因正/负相关的基因；最后，c) 搜索常见观察到的基因。我们采用相关值 cutoff |>0.5|，p-value <0.05作为搜索标准。为缩小HLA-DR和PD1之间共享靶点的搜索，仅考虑在最大数据集中检测到的基因。因此，对于与HLA-DR和PD1相关的基因，我们使用在至少3个数据集中显著的基因。

2.11 统计分析

统计分析使用GraphPad Prism v8进行。样本间比较使用适当的统计检验进行，包括非参数Mann-Whitney检验、配对t检验、单因素ANOVA或双因素ANOVA与多重比较，取决于实验设计和数据分布。所有实验至少进行三个独立生物学重复。对于涉及PBMCs的实验，每个生物学重复从不同 donor 获取以考虑 donor 间变异性。统计显著性确定为p值小于0.05 considered significant。显著性水平表示如下：一个符号（）表示p<0.05，两个符号（）表示p<0.01，三个符号（）表示p<0.001，四个符号（）表示p<0.0001。

3 结果

3.1 CTLs上的HLA-DR表达允许乳腺癌细胞消除

先前，我们报道了活检中CTLs（在CD8+群体内分析）的HLA-DR水平是预测BC对NACT反应的稳健生物标志物。此外，我们证明了肿瘤浸润CTLs中HLA-DR水平与系统性CTLs中HLA-DR水平呈正相关。

在本文中，为进一步研究来自BC患者血液的HLA-DR表达CTLs的抗肿瘤效应，并比较富含HLA-DR表达CTLs的PBMC群体与较少富集群体的肿瘤细胞消除能力，我们进行了体外和体内实验。具体而言，我们采用了一个体外系统，利用BC细胞系和患者衍生PBMCs之间的同种异体性，从而能够评估T细胞毒性。这种设置使我们能够观察到，当CD3/CD28刺激的PBMCs被添加到BC细胞系MDA-MB-231的球体中时，导致肿瘤细胞活力下降，这种效应依赖于PBMCs内HLA-DR表达CTLs的频率。确实，在BC患者血液中HLA-DR表达CTLs的百分比与PBMCs杀死肿瘤细胞的能力之间建立了正相关（Spearman r=0.5429, p=0.0479）。此外，将分选的HLA-DR表达CTLs添加到BC球体显示出与添加无HLA-DR的分选CTLs相比增强的细胞毒性能力（p=0.0323）。值得注意的是，两个分选群体表现出等效水平的经典激活标记CD25，突出了HLA-DR在增强CTLs介导肿瘤细胞消除中的关键作用。

这些观察在体内通过斑马鱼 avatar 模型实验得到进一步证实，该模型产生了与球体 comparable 的结果。该模型的一个关键优势是适应性免疫仅在受精后2-3周完全成熟，为在受控环境中研究人类肿瘤-免疫相互作用提供了独特窗口。这种能力提供了HLA-DR表达CTLs在体内肿瘤减少中作用的补充和准确评估。具体而言，携带人类BC细胞系Hs578T的异种移植斑马鱼，注射来自具有高频率CTLs表达高水平HLA-DR的BC患者的PBMCs，显示出与注射来自具有这些细胞低频率 donors 的PBMCs相比肿瘤大小的显著减少（p<0.001）。

这些结果表明，HLA-DR表达CTLs不仅是NACT反应的生物标志物，如我们先前报道，而且在促进体外和体内肿瘤细胞消除方面更具能力。

3.2 CTLs和CD4+ T细胞中的HLA-DR对于有效CTLs激活和建立抗肿瘤免疫反应至关重要

为探索CTLs中HLA-DR的治疗潜力，我们研究了当HLA-DR被特异性抗体阻断时，CD3/CD28刺激的CTLs的激活和细胞毒性 profile。为此，我们评估了反映CTLs激活不同阶段的各种标记的表达和与细胞毒性功能相关的效应分子Granzyme B。

值得注意的是，阻断HLA-DR导致CTLs upon stimulation 变得激活和细胞毒性的能力减少，如CTLs群体内CD25+、CD69+和Granzyme B+细胞频率减少所证明。相反，HLA-DR阻断对CD4+ T细胞的激活没有显著影响，这些细胞被单独分析。如预期，HLA-DR阻断显著减少了HLA-DR+CTLs的频率，类似于在非刺激条件下观察到的那些。即使我们的实验中使用了总PBMCs，并且阻断可能影响CTLs以外其他细胞表达的HLA-DR，这些发现强调了CTLs自身内HLA-DR表达在促进其激活和细胞毒性能力中的关键重要性。

重要的是，为确保我们结果的特异性，我们在平行实验中包含了同种型对照。添加同种型对照抗体，在与HLA-DR阻断抗体相同浓度下，不影响T细胞激活或细胞毒性，确认观察到的效应是HLA-DR阻断特异性的。

此外，考虑到HLA-DR是使抗原呈递给CD4+ T细胞的抗原呈递分子，我们进行了去除CD4+ T细胞的PBMCs实验。有趣的是，去除CD4+ T细胞的PBMCs刺激对CTL激活影响最小，如各种激活标记阳性细胞百分比 largely unchanged 所证明（灰色条），与CD4+ T细胞存在的条件相反（红色条，p < 0.05）。有趣的是，在测试的标记中，只有CD69 - 一个T细胞激活的较早标记 - 在缺乏CD4⁺ T细胞时 upon stimulation 显示 modest 增加，可能表明一个瞬态、初始激活信号。这些观察强调了CD4+ T细胞对于稳健和 prolonged CTL激活的重要性。

通过HLA-DR阻断或CD4+ T细胞去除破坏CTLs和CD4+ T细胞之间的相互作用可能损害抗肿瘤免疫反应，表明HLA-DR和CD4+ T细胞在CTLs激活和细胞毒性能力中的关键作用。

3.3 CTLs的治疗潜力可通过短期扩增提升

近期努力集中于精炼T细胞的体外扩增用于治疗目的。这一追求旨在增加其数量用于过继性T细胞转移方案并增强其识别和破坏恶性细胞的能力，从而改善治疗疗效。

在此背景下，我们探索了T细胞扩增 dynamics，特别关注HLA-DR表达CTLs，使用从健康 donors 分离的PBMCs。我们评估了各种免疫细胞扩增方案，旨在优化其数量和功能。我们的发现揭示了免疫细胞可以成功地在体外扩增长达14天，使用T细胞受体刺激结合细胞因子 cocktails。最有效的扩增方案使用anti-CD3（5 μg/mL）和anti-CD28（1 μg/mL）抗体，以及IL-2和IL-12。因此，我们在后续实验中选择此方法。

然而，虽然PBMCs总数在扩增方案期间增加，但我们观察到 specifically HLA-DR表达CTLs在最初几天增加但在4到5天后遭受下降，无论使用何种细胞因子 cocktail。此外，CTLs中HLA-DR表达水平遵循相同趋势，表达峰值 around 4–5天。有趣的是，我们的结果还证明短期刺激方案（5天）导致CTLs上HLA-DR表达上调 compared to prolonged expansion method（14天）。此外，采用3D共培养模型的实验显示，当与扩增14天的淋巴细胞共培养时，肿瘤细胞活力增加，表明这些细胞与短期刺激细胞（5天；p=0.0036）相比细胞毒性活动减少。值得注意的是，我们还证明，扩增较长时间的细胞即使以更高比例添加到BC细胞（8 PBMCs 对 1 BC细胞）也表现出 diminished 细胞毒性能力， compared to 扩增较短持续时间的细胞，后者仅以3 PBMCs 对 1 BC细胞的比例添加到BC细胞。虽然扩增14天的PBMCs，即使以更高效应子与靶标（E:T）比例（8000细胞）使用，也未诱导MDA-MB-231细胞活力的显著减少，与短期扩增PBMCs（3000细胞）形成对比，后者尽管以较低E:T比例存在但更有效。这种由较少扩增PBMCs展示的更高细胞毒性能力最可能是因为短刺激导致比长刺激更多HLA-DR表达CTLs，如图3C所示。

这些结果强调了优先考虑扩增方案的重要性，这些方案保证CTLs的有效细胞毒性能力，我们证明这强烈依赖于HLA-DR表达，通过短期模拟实现。

3.4 抗PD-1治疗有助于增加CTLs中的HLA-DR并放大其抗肿瘤活动

使用我们建立的3D共培养模型作为筛选平台，我们测试了旨在增加CTLs HLA-DR表达并 consequently 其针对BC细胞细胞毒性的潜在药物，与先前显示的结果一致。我们的筛选涵盖了几个有前景的药物和不同BC细胞系。

遵循我们先前对HLA-DR+CTLs与HLA-DRneg CTLs的免疫 profile 表征，其揭示了几个刺激性共受体在HLA-DR+CTLs中更高表达，我们假设用激动剂靶向这些共受体可能促进HLA-DRneg CTLs向HLA-DR+CTLs表型转化。为探索这种可能性，我们在筛选中包括了这些激动剂中的两个，anti-CD137和anti-CD134/OX40，两者目前正在多项临床试验中研究。

此外，我们包括了Nivolumab，一种靶向PD-1的免疫检查点抑制剂，通过PD-1/PD-L1轴阻断增强针对癌细胞的免疫反应，和Bevacizumab，一种靶向并中和血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，其也被报道具有免疫刺激特性。两者已广泛用于不同实体癌的临床实践。

Nivolumab显著增强了激活CTLs针对MDA-MB-231和HCC1806的抗肿瘤特性，而其他测试药物未显示任何改善针对这些BC细胞系细胞毒性的效应（p=0.0163）。这些实验使用从健康 donors 获得并如上所述刺激的PBMCs进行。

值得注意的是，我们的结果还表明，Nivolumab治疗体外增加了健康 donors PBMCs中HLA-DR+CTLs的百分比。

重要的是，与图4A中观察到的增强细胞毒性一致，来自转移性BC患者的PBMCs，其自然 exhibit 低或无效 basal levels of HLA-DR expression in CTLs，在刺激加上体外Nivolumab治疗后也显示增加细胞毒性能力（p = 0.0487）。

支持我们的发现，即Nivolumab通过HLA-DR增量提升CTL细胞毒性，在3D共培养中阻断HLA-DR，也使用健康 donors PBMCs进行，削弱了Nivolumab的效应，导致CTLs细胞毒性能力 diminished。值得注意的是，暴露于Nivolumab的未刺激PBMCs未显著影响肿瘤细胞活力。这表明Nivolumab更多作为佐剂，仅在存在额外微环境刺激下改善T细胞介导肿瘤细胞 killing。

与此想法一致，只有一部分接受抗PD-1治疗的BC患者在其血液中 exhibit 增加CTLs表达HLA-DR的频率以及CTLs上 elevated HLA-DR表达水平，治疗开始后四个月。这种观察到的异质性可能反映了肿瘤微环境因素的差异，这些因素可变地支持或损害有效CTLs激活和效应子功能。

总体而言，我们的发现表明抗PD-1治疗在通过HLA-DR提升CTLs细胞毒性