特应性皮炎患者肠道DEFA5+CD4+T细胞介导肠道炎症的新机制与PPARγ调控作用研究

本研究通过单细胞测序技术首次揭示特应性皮炎（AD）患者肠道中DEFA5阳性CD4+上皮内淋巴细胞（IELs）的异常活化现象，证实其通过PPARγ信号通路促进肠道屏障损伤和炎症反应，为AD相关胃肠症状提供了新的治疗靶点。

　　

Rationale

特应性皮炎（AD）作为一种慢性免疫介导的炎症性皮肤疾病，与多种胃肠道症状存在显著关联，但其潜在机制尚未明确。本研究旨在探究AD患者肠道上皮内淋巴细胞（IELs）的特征及其在肠道炎症发展中的潜在作用。

Methods

研究采用单细胞RNA测序技术对重症成人AD患者回肠部位的免疫细胞组成进行分析。通过激光共聚焦显微镜、Western blot、聚合酶链反应以及过继性T细胞转移实验等多重技术手段，深入探究IELs的表型特征及CD4⁺IELs在肠道炎症和屏障功能中的作用。

Results

在AD患者小肠中发现一群独特的表达DEFA5的CD4⁺T细胞，这些细胞显著富集于组织驻留记忆T细胞（Trm）群体。研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）对DEFA5阳性CD4⁺IELs的功能具有重要调控作用。在AD小鼠模型中，与对照组相比，DEFA5阳性CD4⁺IELs数量显著增加，并且这些细胞直接导致肠道炎症发展和肠道屏障功能受损。

Conclusions

AD与肠道DEFA5阳性CD4⁺IELs的增加密切相关，这些细胞可能在介导肠道炎症中发挥重要作用。研究表明DEFA5阳性CD4⁺IELs可作为治疗AD患者胃肠道症状的潜在靶点。

Introduction

宿主防御肽是先天免疫系统中进化保守的分子，在多种生物体中表现出直接的抗菌活性和免疫调节功能。在哺乳动物中，这些肽主要分为防御素和cathelicidins两大类。防御素又进一步分为α型、β型和θ型，其中仅α和β防御素在人类中得到确认。迄今为止，人类已发现6种α防御素，根据编码外显子的差异分为髓系和肠道α防御素。防御素α5（DEFA5）最初被鉴定为潘氏细胞特异性肽，局限于肠道隐窝基部。后续研究发现DEFA5也可在其他组织粘膜上皮中检测到，如生殖道和呼吸道。除抗菌特性外，DEFA5可能被志贺氏菌等细菌利用来促进其粘附和侵袭。此外，DEFA5对多种免疫细胞包括巨噬细胞、肥大细胞以及幼稚和记忆T淋巴细胞具有强效趋化作用。更重要的是，它能诱导CD4⁺T细胞中IL2、IL8和IFNγ的表达，表明其可能通过调节免疫细胞的募集和功能来调控肠道炎症。

在健康小肠中，上皮内淋巴细胞（IELs）与上皮细胞的比率约为每100个上皮细胞对应10-20个IELs，表明IELs是肠道免疫环境中的主要淋巴细胞群体。IELs被认为是肠道组织驻留记忆T（Trm）细胞的主要组成部分。先前研究表明，炎症性肠病患者肠道粘膜中CD4⁺Trm细胞显著增加，并促进促炎症反应。基于发育谱系和表型特征，CD4⁺IELs被归类为诱导型IELs。这些诱导型IELs对外周遇到的抗原发生反应，随后迁移到肠道上皮层，并表达激活标志物CD69和CD25。研究还表明CD8⁺IELs能够直接产生多种α防御素，这一过程依赖于Toll样受体的激活。

越来越多的证据表明胃肠道和皮肤病之间存在相互关联。特应性皮炎（AD）是一种慢性免疫介导的炎症性皮肤疾病，流行病学数据显示其成人患病率约为2.1-4.9%。值得注意的是，超过50%的儿科患者表现出成年期复发的倾向。最近发现约28.6%和24.1%的成人AD患者分别表现出伴随的食物敏感性和与胃肠道炎症相关的过敏反应，表明皮肤病和胃肠道病理之间存在双向关系。然而，这些关联的精确分子机制尚未完全阐明。有趣的是，AD患者体内α防御素水平升高已被报道，但α防御素的来源及其对AD相关肠道炎症的贡献尚不清楚。

Materials and methods

Patient cohorts

研究纳入了5名AD患者和5名健康志愿者，所有个体均在2021年12月至2022年7月期间在广东省中医院接受治疗。本研究获得广州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号BF2021-220-01）。所有参与者均在参与前提供书面知情同意。

Preparation of single-cell suspensions

组织样本用预冷PBS洗涤后立即在冰上切成1mm3碎片。使用0.5 U/mL dispase II、50 U/mL DNase I、285 U/mL collagenase I和355 U/mL collagenase II的混合酶在37°C下消化45分钟。消化后样本通过70μm细胞筛网过滤，300×g离心5分钟。细胞沉淀用红细胞裂解液处理，最后通过35μm细胞筛网过滤确保单细胞分离。

Single-cell RNA sequencing

使用10× Genomics Chromium Controller Instrument和Chromium Single Cell 3’V3 Reagent Kits生成scRNA-Seq文库。每个样本约加载8,000个细胞，目标在每个GEM系统中条形码标记约5,000个单细胞。采用Illumina测序仪进行150bp双端测序，确保每个细胞50,000 reads的测序深度。

Single-cell RNA statistical analysis

使用NovelBio公司提供的NovelBrain云分析平台进行单细胞RNA-seq数据分析。采用CellRanger v6.1.1将数据比对到人类基因组参考GRCh38，生成特征-条形码矩阵。使用Seurat包（版本4.0.3）进行数据标准化和回归分析，基于2000个变异最大的基因进行主成分分析。

Animals

六周龄雄性BALB/c小鼠在温度23±3°C、相对湿度55±5%、12小时光暗循环的控制环境中饲养。所有动物实验均严格按照实验动物使用伦理相关法规进行。

Oxazolone-induced AD in BALB/c mice

采用oxazolone诱导的AD小鼠模型。小鼠背部3.5cm×3.5cm区域剃毛后，应用3% oxazolone致敏混合物7天。第8天开始用1% oxazolone溶液攻击左耳两侧，共进行7次挑战。

Flow cytometry

IELs和脾淋巴细胞（SPLs）先用Fc受体阻断剂处理，然后在4°C下与特异性抗体孵育30分钟。细胞内染色时，细胞先用PMA、ionomycin和Brefeldin A预处理5小时。

Isolation of IELs and SPLs

小鼠肠道切除后仔细去除残留肠系膜脂肪组织，剔除派尔集合淋巴结。肠段切成1.5cm片段，用5mM EDTA在HBSS中孵育两次，每次15-20分钟。

Sorting and stimulation of CD4⁺ T cells for secretion

使用小鼠CD4⁺T细胞分离试剂盒分离CD4⁺T细胞。纯化后的细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中37°C培养24小时。

Cell culture

HT-29细胞在含10% FBS和1%青霉素/链霉素的McCoy's 5A培养基中培养。细胞在DEFA5处理前进行饥饿处理。

Intestinal explant culture

末端回肠切成0.5cm片段，与刺激或未刺激的CD4⁺IELs在24孔板中共培养24小时。

Adoptive transfer of CD4⁺ IELs

SCID小鼠建立AD模型后第7天进行过继转移。从Balb/c小鼠小肠分离CD4⁺IELs，腹腔注射1 * 10⁶个细胞。

Western blotting

细胞和组织样本用RIPA缓冲液裂解提取蛋白质。蛋白质通过10-12% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜。

Confocal microscopy

CD4⁺IELs与CD4和DEFA5一抗在4°C孵育过夜，核用DAPI/Hoechst染色5分钟。

Real-time polymerase chain reaction

使用TRIzol试剂从CD4⁺IELs和CD4⁺SPLs中提取RNA。

Statistical analyses

使用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。两组间比较采用非配对Student t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）与Bonferroni事后校正。

Results

AD患者通过单细胞RNA-seq分析显示独特的基因表达模式

为研究AD患者肠道免疫组成，收集5名成人AD患者和5名正常对照者的末端回肠组织样本进行单细胞RNA-seq分析。经过严格质量控制后，共获得75,912个细胞（AD组43,085个，对照组32,827个）。利用簇特异性标记基因和无监督t-SNE分析，共鉴定出22个细胞簇。tSNE图显示了NC和AD组中的细胞分布。总共5个簇（包括簇4、6、7、19和21）基于CD3D、CD3E和PTPRC的差异基因表达被分类为T_NK细胞。

通过tSNE分析进一步细化T_NK细胞群中的细胞群体。鉴定出的T_NK细胞分为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、NK细胞和γδT细胞。NKT细胞（簇4）、NK细胞（簇8和9）以及γδT细胞（簇0、1、2、3、5、6和7）构成较小比例，被分为8个不同的簇。对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞进行差异基因表达分析发现，DEFA5是AD组相比NC组上调最显著的基因之一。鉴于CD8⁺T细胞能够分泌多种α防御素的证据，研究人员假设肠道CD4⁺T细胞可能具有类似功能。对供体CD4⁺T细胞中DEFA5表达的独立分析证实了该基因在AD患者中的表达增加。

AD患者肠道CD4⁺T细胞中防御素的表达

接下来分析了T_NK细胞中几种关键细胞类型（包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和γδT细胞）中DEFA5的表达，发现AD组所有类型细胞中DEFA5表达均显著高于NC组。随后的CD4⁺T细胞基因本体富集分析显示防御素相关基因集显著富集，包括"对病毒的防御反应"、"宿主对病毒防御反应的调节"和"在其他生物体中的膜破坏"。此外，DEFA5阳性CD4⁺T细胞亚群的通路分析显示，差异富集最显著的通路包括PPAR信号通路、MAPK信号通路和NOD信号通路。特别值得注意的是，PPAR信号通路是AD组CD4⁺T细胞中上调最显著的通路。

研究人员最初尝试将DEFA5表达CD4⁺T细胞分为Th1（IFNG⁺、CXCR3⁺、CCR5⁺、IL2⁺）、Th2（IL10⁺、IL4⁺、IL5⁺、IL13⁺）和Th17（IL17A⁺、IL17F⁺、IL22⁺）亚群，但发现DEFA5主要富集在一个先前未表征的细胞群体中。为进一步表征DEFA5表达CD4⁺T细胞，分析并鉴定了六个不同的CD4⁺T细胞亚簇，包括CD4⁺初始T细胞（CCR7⁺、SELL⁺、LEF1⁺、TCF7⁺）、滤泡辅助T（Tfh）细胞（CXCR5⁺、CD200⁺、TOX⁺、TOX2⁺）、CD4⁺中央记忆T（Tcm）细胞（CCR7⁺、TCF7⁺、CD69⁺）、CD4⁺效应记忆T（Tem）/TH1样细胞（IFNG⁺、CCL5⁺、GZMK⁺）、CD4⁺驻留记忆T（Trm）细胞（CXCR6⁺、KLRB1⁺）和Treg细胞（FOXP3⁺、IKZF2⁺、CTLA4⁺）。结果显示AD组肠道CD4⁺T细胞中DEFA5表达显著增加，且DEFA5表达主要富集在Tcm和Trm细胞中。基于CD4⁺T细胞表现出的显著转录组特征，研究人员进行了伪时间轨迹分析，结果表明肠道T细胞从初始CD4⁺T细胞分化可能 diverged into two distinct evolutionary pathways：一条通向Treg/Tfh细胞状态，另一条通向Trm细胞。为进一步了解CD4⁺T细胞簇的生物学特征，应用定量集分析显示PPAR信号通路主要富集在Trm细胞（簇4）中。

DEFA5与异常CD4⁺IELs激活的共定位

为深入了解AD中肠道CD4⁺T细胞产生DEFA5的潜在机制，建立了oxazolone介导的AD小鼠模型。与对照组相比，oxazolone处理的小鼠耳朵和背部出现明显红肿，耳厚度显著增加。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）被认为是推进AD的关键标志物，并与疾病相关的肠道菌群失衡有关。TSLP的Western blot分析显示处理组小鼠耳朵中该蛋白水平升高，证实了AD小鼠模型的成功建立。

IELs构成肠道内最丰富的淋巴系统，IELs中的CD4⁺T细胞主要位于小肠远端部分。IELs也被认为是最大量和肠道特异性Trm细胞亚群之一。因此，研究人员从小鼠肠道中分离单个CD4⁺IELs，通过共聚焦显微镜检测。发现 stimulated CD4⁺IELs比unstimulated CD4⁺IELs产生更多DEFA5，CD4和DEFA5明显共定位。此外，流式细胞术结果显示AD小鼠CD4⁺IELs中CD25和CD69显著增加，表明AD小鼠CD4⁺IELs存在异常激活。

PPARγ调控CD4⁺IELs中DEFA5表达

为测试激活是否会导致其他组织CD4⁺T细胞表达DEFA5，通过PCR评估了激活后脾脏和IELs中CD4⁺T细胞的DEFA5表达。结果显示CD4⁺IELs而非脾脏CD4⁺T细胞能够表达DEFA5。此外，stimulated CD4⁺IELs的DEFA5表达显著高于unstimulated CD4⁺IELs。

上皮细胞，特别是潘氏细胞，被认为是DEFA5的主要生产者。为解决潘氏细胞和其他上皮细胞污染的可能性，检测了分离的CD4⁺IELs中潘氏细胞特异性标志物和上皮细胞特异性标志物的表达，包括Sox9、Epcam、ctnnb1、Lyz2、Lyz1和Cd24a。结果显示这些基因在分离的IELs中检测不到，表明获得的CD4⁺IELs不太可能被潘氏细胞或上皮细胞污染。此外，纯化CD4⁺IELs的流式细胞术评估显示99.8%的CD45⁺细胞为CD4⁺，非免疫或非CD4⁺T细胞存在极少。

初步单细胞RNA测序分析显示PPAR信号通路在AD组中显著上调。因此评估了小鼠肠道中PPARγ的表达。与对照组相比，AD小鼠肠道中PPARγ mRNA和蛋白水平显著增加。先前研究发现PPARγ激活在维持肠道内防御素表达中起关键作用。为研究PPARγ是否能调控DEFA5，使用AlphaFold3可视化DEFA5和PPARγ之间的直接结合界面可能性。此外，利用GEPIA网络工具进行Spearman相关分析，研究DEFA5和PPARG基因表达之间的关联。结果显示PPARG和DEFA5表达之间存在显著正相关（R = 0.54, p < 0.001），表明PPARγ表达增加常与DEFA5上调相关。接下来使用PPARγ抑制剂GW9662测试该分子在CD4⁺IELs表达DEFA5中的作用。结果显示添加GW9662后，与未抑制PPARγ的细胞相比，DEFA5表达显著降低，表明PPARγ在调控CD4⁺IELs表达DEFA5中起重要作用。

CD4⁺IELs可能通过DEFA5促进AD相关肠道损伤

诱导AD后，发现AD组小鼠体重较对照组显著减轻。此外，评估了肠道中Epcam、Ephb3和ZO-1的mRNA表达以及IL-1β的蛋白水平。发现AD小鼠Epcam、Ephb3和ZO-1表达降低，但IL-1β表达增加，表明肠道屏障功能受损和肠道炎症发展。AD患者常出现腹痛、腹胀和腹泻等胃肠道症状，这一现象在各种AD动物模型中也得到验证。在这种情况下，肠道炎症可能导致肠道CD4⁺T细胞异常激活，产生DEFA5。

潘氏细胞是人类DEFA5的主要细胞来源。单细胞转录组分析显示AD患者回肠中潘氏细胞丰度增加。此外，肠道上皮中AD组DEFA5表达显著高于NC组。研究表明DEFA5局部浓度升高也是诱导凋亡的因素之一。为验证这一点，用1μg/ml和2μg/ml DEFA5处理肠道上皮细胞系HT-29细胞，然后通过Western blot检测ZO-1和IL-1β。结果显示ZO-1表达呈剂量依赖性降低，IL-1β增加，表明DEFA5可能在AD肠道屏障功能损害和肠道炎症发展中起重要作用。

为研究CD4⁺IELs对AD小鼠肠道炎症发展的贡献，将CD4⁺IELs过继转移到有或无AD诱导的SCID小鼠中。与NC组和未进行T细胞转移的AD组相比，接受CD4⁺IELs的SCID小鼠PPARγ表达显著增加，同时IL-1β和IFNγ水平升高。此外，将肠道外植体与stimulated或unstimulated CD4⁺IELs共培养。与stimulated CD4⁺IELs共培养的外植体中ZO-1表达显著低于与unstimulated CD4⁺IELs共培养或无CD4⁺IELs共培养的组。这些结果表明CD4⁺IELs的异常增加可能是导致AD肠道炎症发展的关键因素。

Discussion

先前研究表明特应性皮炎（AD）通常先于其他类型的过敏性疾病发生，随后伴随各种胃肠道症状。本研究结果表明AD相关肠道炎症可能与肠道免疫细胞功能变化有关。基于单细胞转录组分析，检测到肠道CD4⁺T细胞中DEFA5的异常表达。进一步研究表明这种异常DEFA5表达是CD4⁺IELs特有的，因为在脾脏CD4⁺T细胞中未发现。此外，发现PPARγ对CD4⁺IELs表达DEFA5很重要。

最近研究提供了AD小鼠和犬模型中肠道炎症和屏障功能受损的证据。此外，一项涉及4,175名参与者的调查发现AD患者胃肠道疾病患病率高于对照组。目前关于AD肠道炎症机制的研究主要集中于肠道微生物群，但一些研究证实微生物不是AD相关胃肠道炎症的介质。此外，当前关于AD的单细胞RNA测序工作主要集中于皮肤而非肠道。因此，研究人员旨在通过应用单细胞RNA测序阐明AD与胃肠道炎症之间的关系。 consequently鉴定出22个细胞簇，包括上皮细胞类型、内皮细胞、T_NK细胞、B细胞群体、浆细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和肥大细胞。考虑到T细胞在炎症和防御素产生中的关键作用，注释了T_NK细胞簇的转录组特征。基于差异基因表达分析，观察到AD组T细胞中DEFA5表达显著增加。进一步研究发现这些患者肠道CD4⁺T细胞中DEFA5表达异常增加。基因本体富集分析表明CD4⁺T细胞与防御素产生密切相关。

先前一项AD单细胞RNA测序研究表明，与正常皮肤相比，AD皮损皮肤表现出更明显的CD4⁺Trm细胞浸润。本研究通过伪时间轨迹分析和QuSAGE，同样观察到AD患者肠道中CD4⁺Trm细胞丰度增加 compared to NCs。有趣的是，在慢性肠道炎症中，CD4⁺Trm细胞被发现加速疾病进展。CD4⁺Trm细胞很可能 contribute to the development of intestinal inflammation and impaired barrier function in AD patients。

已知CD4⁺IELs通过分泌炎症因子促进炎症。使用从小鼠肠道分离的单个CD4⁺IELs，证明了CD4和DEFA5的共定位。此外，stimulated CD4⁺IELs表现出比unstimulated细胞显著增加的DEFA5表达。流式细胞术数据显示与NC组相比，AD组CD4⁺IELs中CD69和CD25表达显著增加。研究人员考虑到CD25⁺细胞可能是调节性T细胞（Tregs），但先前研究也显示CD25可指示T细胞激活。本研究发现CD25与CD69共表达，这种模式表明这些细胞很可能是活化的CD4⁺IELs而非Tregs。基于单细胞RNA测序结果，进一步表明CD4⁺IELs而非脾脏CD4⁺T细胞能够表达DEFA5，促进肠道炎症加剧。

PPAR家族成员已被证明调节T细胞激活和分化。一致地，观察到过继转移CD4⁺IELs的SCID小鼠中PPARγ表达增加，同时炎症细胞因子上调。先前研究表明核受体PPARγ在粘膜防御调节中起作用。例如，肠道微生物组成分如鼠李糖乳杆菌I5007已被证明促进丁酸盐产生并激活PPARγ，从而增强防御素水平。AD皮脂腺的空间转录组分析显示PPARγ基因显著富集，表明其与疾病相关。通路分析结果显示AD肠道中PPAR通路上调。因此，研究人员假设CD4⁺T细胞产生DEFA5的机制可能与PPARγ有关。为研究PPAR在调控DEFA5表达中的作用，使用PPARγ抑制剂（GW9662）确定PPARγ的调控作用。结果证实了该分子在CD4⁺IELs表达DEFA5中的重要性。

DEFA5通常在肠道环境中充当"保护者"，但研究也显示溃疡性结肠炎患者末端回肠中DEFA5显著高于健康对照。此外，发现DEFA5水平较高的患者也更可能经历 pouchitis 复发。这些研究表明DEFA5在某些条件下可能是疾病发病的促成因素。本研究中，也证明DEFA5处理导致紧密连接蛋白表达减少和炎症因子表达增加。因此，CD4⁺IELs介导的局部DEFA5上调可能加剧肠道炎症， potentially representing AD肠道损伤的重要机制。然而，DEFA5 contribute to intestinal inflammation的确切机制尚未阐明。研究人员推测这可能与免疫细胞募集及其对肠道微生物动态的影响有关。生物信息学分析结合机器学习技术表明DEFA5是与溃疡性结肠炎进展显著相关的关键基因。因此，DEFA5有希望作为辨别AD临床表现中肠道损伤存在的潜在生物标志物候选物。然而，证实这一潜力需要额外的调查研究。例如，使用DEFA5敲除小鼠的CD4⁺IELs或过继转移不能产生DEFA5的CD4⁺T细胞群体作为对照组，将有助于进一步阐明DEFA5对AD相关肠道炎症的具体贡献。

尽管单细胞转录组分析揭示了AD患者末端回肠组织细胞中DEFA5的差异表达，但样本量有限，仅5名患者纳入健康对照。本研究的另一个局限性是未评估DEFA5⁺CD4⁺T细胞的TCR repertoire。未来纳入TCR-seq的研究将有价值地阐明该细胞亚群的抗原特异性和发育轨迹。

总之，利用单细胞RNA测序方法，鉴定了AD患者末端回肠组织中的异常基因表达。此外，发现了CD4⁺IELs在产生DEFA5中的新功能，表明CD4⁺T淋巴细胞在某些自身免疫疾病背景下可能 adopt new roles。探索这些细胞在各种微环境中的功能可能为治疗策略提供新的视角。