CD5 CAR-NK细胞信号强度微调策略：靶向T细胞恶性肿瘤治疗的新突破

本综述系统探讨了通过精细调控CD5 CAR-NK细胞中单链抗体片段（scFv）的特性和CAR表达密度，实现对T细胞恶性肿瘤（如T-ALL）的高效靶向治疗。研究揭示了基于信号强度优化的CAR设计可显著提升抗肿瘤活性（如对MOLT4细胞系杀伤率达90%），同时降低对正常T细胞的脱靶毒性（仅6%）。关键机制涉及恶性细胞特异性配体B7-H6与NK细胞活化受体NKp30的差异互作，以及ERK/AKT信号通路的精细调控。该策略为CAR疗法在T细胞肿瘤领域的应用提供了兼顾疗效与安全性的新范式。

　　

1 Introduction

T细胞恶性肿瘤是具有高复发率和低生存率的侵袭性血液癌症，现有治疗方法包括化疗、免疫疗法、靶向治疗和造血干细胞移植效果有限。CAR-T疗法在B细胞肿瘤中成效显著，但应用于T细胞肿瘤时面临靶点重叠导致的 fratricide（自相残杀）、T细胞发育不全等挑战。自然杀伤（NK）细胞因不表达T细胞标志物（如CD5），且具备天然区分异常细胞的能力，成为CAR疗法的理想候选。CD5作为T细胞恶性肿瘤的关键靶点，在正常T细胞和B细胞亚群中亦有表达，因此CD5 CAR-NK疗法需精准平衡抗肿瘤活性和脱靶毒性。本研究通过调控scFv特性和CAR表达密度，旨在开发兼具高效性与安全性的优化CD5 CAR-NK（OptiCAR-NK）疗法。

2 Materials and methods

研究采用NK92细胞系和脐带血（UCB）来源的原代NK细胞，通过慢病毒转导构建表达不同scFv克隆（#1、#4、#11、#14）的CD5 CAR-NK细胞。CAR结构包含CD28和DAP10共刺激域及CD3ζ信号域。通过单细胞分选和mRNA转染调控CAR表达水平。体外功能实验采用钙黄绿素（calcein-AM）释放法和乳酸脱氢酶（LDH）法评估细胞毒性，流式细胞术分析CD107a脱颗粒和细胞因子分泌。体内研究采用NOD.Cg-Prkdc^scidIL2γg^tm1Sug/JicKoat（NOG）小鼠模型，通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤负荷。靶细胞配体表达通过抗体染色和Western blot（检测pERK/pAKT信号）进行表征。

3 Results

3.1 Generation of stable CD5 CAR-NK cells with different scFvs

从抗CD5 scFv库中筛选出结合效率最高的4个克隆（#1、#4、#11、#14），构建为第三代CAR结构。流式细胞术证实CAR在NK92细胞中的稳定表达，且各克隆增殖能力无显著差异（CCK-8法验证）。

3.2 CD5 CAR-NK cells show robust anti-cancer activity against malignant T cells based on scFv type

CD5⁺恶性T细胞系（MOLT4、CCRF-CEM、Jurkat）的杀伤实验显示，#11和#14克隆具有最高细胞毒性（E:T=2:1时杀伤率>80%），而CD5^-细胞系U937未见显著杀伤。原代UCB-NK细胞转染CAR mRNA后重现该趋势，#11和#14克隆特异性激活CD107a和IFN-γ分泌。

3.3 Normal T cells are less susceptible to CD5 CAR-NK cells under adequate scFv and CAR expression

UCB来源的单核细胞（MNC，含40-90% CD5⁺ T细胞）中，#11克隆对正常细胞毒性最低（约6%），而#14克隆毒性较高。通过单细胞分选获得不同CAR表达水平的单克隆细胞（L1-L4），发现L1（低CAR表达）对MOLT4杀伤率达38%，但对MNC毒性仅6%，选择性指数最优。延长共培养至48小时后，对恶性细胞杀伤率超90%，而对正常细胞毒性维持低水平。

3.4 Increased sensitivity of CD5 CAR-NK cells to malignant T cells is modulated by scFv, CAR expression, and differential ligand presentation

Western blot显示恶性细胞共育后CAR-NK的pERK/pAKT信号显著强于正常细胞。流式细胞术发现恶性细胞高表达NK细胞活化配体B7-H6（NKp30受体配体）和ULBP1/2/5/6（NKG2D配体），而正常细胞几乎不表达B7-H6。下调MOLT4中B7-H6后，CAR-NK细胞毒性降低。mRNA转染调控CAR表达水平实验表明，细胞毒性与CAR密度和靶细胞B7-H6水平呈正相关，#11克隆在较宽CAR表达范围内保持高选择性（肿瘤杀伤/正常杀伤比值>2）。

3.5 OptiCAR-NK cells achieve significant tumor suppression and prolonged survival in the T cell leukemia xenograft model

NOG小鼠静脉注射MOLT4-Luc细胞后，输注OptiCAR-NK（#11克隆）可显著抑制肿瘤生长（生物发光信号降低>10倍），并延长生存期（Log-rank检验p<0.05）。

3.6 OptiCAR-NK cells exhibit negligible on-target off-tumor toxicity in humanized mouse model

人源化PBMC移植小鼠模型中，OptiCAR-NK处理组与对照组在血液CD45⁺CD3⁺ T细胞比例、血常规参数（WBC、RBC、HGB）及主要器官重量均无显著差异，证实其对正常人类T细胞无显著毒性。

4 Discussion

本研究证明通过scFv筛选（#11克隆最优）和CAR表达密度调控（L1水平），可赋予CD5 CAR-NK细胞区分恶性与正常T细胞的能力。关键机制在于恶性细胞特异性高表达B7-H6等活化配体，与CAR信号形成协同激活效应，而正常细胞因缺乏这些配体需更高CAR强度才能激活，从而形成天然安全窗口。该策略避免了传统安全开关（如HSV-TK）的滞后性控制缺陷，从分子设计层面实现疗效与安全性的源头平衡。未来需在原发性T-ALL样本中进一步验证，并探索其他配体（如MICA/B）的调控潜力。OptiCAR-NK为T细胞恶性肿瘤的过继免疫治疗提供了创新解决方案。