电化学粗化铂微电极增强γ-氨基丁酸和谷氨酸生物传感器灵敏度及其在神经科学研究中的意义

本综述系统探讨了通过电化学粗化（ECR）技术处理铂（Pt）微电极，显著提升γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（GLU）生物传感器性能的创新方法。研究通过扫描电镜（SEM）、拉曼光谱、电化学阻抗谱（EIS）及循环伏安法（CV）等多技术手段，揭示了ECR处理对电极表面形貌、孔隙几何结构及电催化活性的优化机制，实现了H2O2检测灵敏度达6,810±124?nA?μM?1?cm?2，为神经递质实时监测提供了高灵敏度解决方案，对癫痫、神经退行性疾病等研究具有重要推动意义。

　　

1 引言

γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（GLU）是中枢神经系统中维持兴奋-抑制（E/I）平衡的关键神经递质。GABA作为主要抑制性神经递质，调节突触活动并防止过度兴奋；而GLU作为主要兴奋性神经递质，参与突触可塑性、学习与记忆过程。超灵敏检测这两种神经递质对于理解正常神经功能及功能障碍（如癫痫、神经退行性疾病和成瘾等）至关重要。

目前神经递质检测技术包括高效液相色谱电化学检测法（HPLC-ECD）和微透析生物传感器，但这些方法通常缺乏实时监测所需的高时空分辨率。微透析虽被视为金标准，但其探针尺寸较大（数百微米），易导致神经元组织损伤和炎症。相比之下，基于微电极阵列（MEA）的电化学生物传感器具有高空间（数十微米）和时间（亚秒级）分辨率，可实现神经递质的快速实时检测。

酶生物传感器常用于检测非电活性神经递质如GABA和GLU。铂（Pt）MEA因其优异的电催化活性、高导电性、耐腐蚀性、灵敏度、选择性、稳定性和生物相容性，成为体外和体内神经递质传感的理想电极材料。安培法以其高时间分辨率（kHz级采样率）和低检测限（LODs），在酶生物传感器中表现尤为突出。GABA和GLU的浓度通过检测过氧化氢（H₂O₂）在+0.7?V（vs.?Ag/AgCl）恒定电位下的氧化电流来测定，该电流与酶促代谢产生的H₂O₂量成正比。

开发长期实时体内检测的生物传感器需克服电极表面污染和酶降解导致的信号衰减与灵敏度下降等挑战。本研究旨在通过优化电极表面处理技术，提高植入前的初始灵敏度，以应对动物体内植入后灵敏度下降的问题。

2 实验方法

2.1 试剂与化学品

所有化学品均为试剂级，直接使用。L-谷氨酸氧化酶（GOx）和GABA转氨酶（GABASE）购自相关供应商，实验用水为去离子（DI）水。

2.2 测量与表征

采用酒精处理、电化学清洗（ECC）和电化学粗化（ECR）三种表面激活技术。ECR处理在0.5?M高氯酸溶液中进行，施加+1.4?V/?0.25?V方波脉冲，频率范围150–6,000?Hz，处理时间100?s，后续施加?0.2?V阴极偏压180?s。

电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安（CV）测试在5?mM?[Fe(CN)₆]^3?/4?溶液中进行，使用三电极体系。安培测量采用四通道FAST16mkII系统。表面形貌与组成通过激光共聚焦显微镜、拉曼光谱和扫描电镜（SEM）表征。

2.3 酶涂层程序

酶基质溶液含1%牛血清 albumin（BSA）和0.125%戊二醛，与GOx（0.1?U/μL）和GABASE（0.1?U/μL）按8:1:1比例混合。使用Hamilton syringe在Pt微电极表面精确滴涂0.02?μL酶溶液，冷藏48?h完成交联。

2.4 安培校准与神经递质检测

安培测量在50?mL?1X?PBS（pH?7.4）中进行，溶液恒速搅拌（200?rpm）。H₂O₂校准浓度范围为2–10?μM，GABA和GLU校准浓度分别为1–40?μM和5–40?μM，每分钟注入一次，固定电位+0.7?V。

3 结果与讨论

3.1 表面激活对Pt微电极表面性质的影响

SEM图像显示，ECR处理显著增加了电极表面粗糙度和孔隙率，尤其在2,500?Hz频率下效果最为明显。酒精和ECC处理后表面相对光滑清洁，而ECR诱导了再结晶、晶粒生长和颗粒团聚，形成高度异质的多孔表面，且未出现电极分层或结构损坏。表面粗糙度（R_a）从酒精处理的0.001?μm增至ECR处理的0.20?μm，表明电活性表面积增加，有利于提升传感器灵敏度。

拉曼光谱分析显示，酒精和ECC处理后的表面碳膜沉积较少，而ECR处理产生了明显的G峰（~1,585?cm^?1）和D峰（~1,350?cm^?1）。250?Hz处理样品的I_D/I_G比最低（0.503），表明形成了高度有序的石墨碳膜；2,500?Hz处理的样品D峰最窄（122.44?cm^?1），I_D/I_G比为0.532，碳层缺陷域明确且层数最少；而4,000?Hz和6,000?Hz处理则显示较高的碳沉积和缺陷率。H₂O₂灵敏度在2,500?Hz达到峰值，表明理想ECR处理应具有明确缺陷域和最少的石墨层数，碳主要作为杂质存在。

3.2 表面激活技术对H₂O₂灵敏度的影响

3.2.1 酒精处理

酒精处理使H₂O₂灵敏度达到2,502±144?nA?μM^?1?cm^?2，较未处理对照组（1,800±120?nA?μM^?1?cm^?2）提高39%，归因于表面杂质去除和活性铂位点暴露。

3.2.2 ECC处理

ECC处理进一步将灵敏度提升至4,046±151?nA?μM^?1?cm^?2，较酒精处理提高61.7%，得益于电活性表面积增加、表面杂质去除及表面化学改变。

3.2.3 ECR处理

ECR处理在2,500?Hz频率下实现最高H₂O₂灵敏度6,810±103?nA?μM^?1?cm^?2，较ECC提高68.3%，为文献报道的最高值。该优化源于平坦与多孔区域的适宜组合、孔隙几何尺寸与导电性的优化，以及碳杂质的最小化。

3.3 表面激活技术对电化学特性的影响

3.3.1 循环伏安（CV）研究

CV测试表明，ECR处理显著增加了电活性面积。250?Hz处理具有最高氧化峰电流，但ΔE_p较高（~95?mV），表明动力学较慢；2,500?Hz处理虽峰电流稍低，但ΔE_p较低（~88?mV），显示更优的动力学和电催化活性。

3.3.2 频率依赖的电化学界面特性

EIS分析表明，酒精处理后的电极表面存在两个 distinct区域：纳米Pt晶粒形成的平滑表面（区域1）和晶界间的不规则孔隙结构（区域2）。ECC处理去除了吸附层，降低了电荷转移电阻（R_ct）和电容值，区域2导电性提高约20%。ECR处理后的电极表面呈现均匀的微观结构，由异质孔隙作为单一系统运作。等效电路拟合显示，孔隙壁（Q_W）和平坦表面（Q_f）的常数相位元件以及孔隙内电荷转移电阻（R_ctp）是影响电极行为的关键因素。

低频ECR（150–350?Hz）通过Pt纳米晶 fractalization 增加异质性和孔隙导电性，但碳杂质沉积较多；高频处理（750–2,500?Hz）则减少fractalization，平坦区域因Pt氧化而阻抗增加，但孔隙壁保持高导电性且碳杂质较少。2,500?Hz处理因孔隙壁的独特几何结构、高导电性和低碳含量，实现了最优的H₂O₂吸附与灵敏度。

3.4 表面激活技术对GABA和GLU灵敏度及LODs的影响

酒精处理后，GABA和GLU灵敏度分别为7.00±0.6?nA?μM^?1?cm^?2和182.20±4.9?nA?μM^?1?cm^?2；ECC处理分别提高至12±0.3?nA?μM^?1?cm^?2和520±12.3?nA?μM^?1?cm^?2；ECR处理在2,500?Hz下进一步显著提升至45±4.4?nA?μM^?1?cm^?2（GABA）和1,510±47.0?nA?μM^?1?cm^?2（GLU），相应检测限（LODs）为1.60±0.13?nM和12.70±1.73?nM。三批次电极的重复性良好，H₂O₂、GABA和GLU灵敏度的相对标准偏差（%RSD）分别为1.24%、4.73%和3.50%。为提升选择性和抗污染能力，可采用间苯二胺（mPD）尺寸排阻涂层，既往研究表明其能有效抵抗抗坏血酸、尿酸、多巴胺和血清素等常见干扰物。

4 结论

ECR处理通过优化Pt微电极表面形貌、孔隙结构和电化学特性，显著提升了GABA和GLU生物传感器的灵敏度。低频ECR增强孔隙导电性但伴随较多碳杂质沉积，高频ECR则减少fractalization并保持孔隙壁高导电性且碳杂质较少。2,500?Hz处理实现了H₂O₂、GABA和GLU检测灵敏度的显著突破，分别为6,810±124.0?nA?μM^?1?cm^?2、45±4.4?nA?μM^?1?cm^?2和1,510±47.0?nA?μM^?1?cm^?2。该技术简单、可扩展，适用于其他氧化酶生物传感器（如胆碱、乙酰胆碱、乳酸、葡萄糖和胆固醇检测），为神经科学研究及神经系统疾病诊断提供了高性能传感平台。