综述：异种移植中的调节性T细胞（Treg）治疗前景

本综述深入探讨了调节性T细胞（Treg）疗法在异种移植领域的应用前景。文章系统回顾了Treg疗法在同种移植（如肾脏、肝脏移植）中的临床经验（包括安全性、持久性及制造挑战），并聚焦其在克服异种移植（如猪到人）免疫排斥中的潜力。重点提出了通过基因工程改造Treg（如CAR-Treg、TCR-Treg）及人源化猪（如引入HLA分子）的创新策略，旨在降低免疫抑制负担并诱导移植耐受，为未来临床转化提供了重要方向。

　　

1 Introduction

异种移植在过去三年中经历了快速的临床进展。尽管采用了强效的免疫抑制方案，结合了B细胞清除疗法、T细胞活化阻断、补体抑制和大剂量类固醇，但在少数猪到人的心脏和肾脏异种移植中仍观察到了抗体介导和细胞性排斥的迹象。考虑到嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在严重难治性自身免疫性疾病中的成功，这为开发新方法以减少免疫抑制负担提供了机遇之窗。在这方面，调节性T细胞（Treg）疗法是一种有吸引力的策略，因为Treg可以通过基因改造来识别猪器官。本综述总结了从同种移植中Treg疗法获得的经验，更新了异种移植Treg研究的最新进展，并讨论了人源化猪表达人白细胞抗原（HLA）以利用工程化Treg促进耐受的未来前景。

CRISPR-Cas9技术的使用明显提高了猪器官用于人类移植的相容性。最近，在尤卡坦小型猪中实现了多达69个基因组编辑。编辑类型包括破坏聚糖合成基因、灭活PERV元件以及在AAVS1位点引入7个转基因 payload，其中包括用于补体级联的CD46和CD55、用于凝血途径的THBD和PROCR、用于抑制先天免疫细胞的“别吃我”分子CD47，以及减少缺血再灌注损伤的TNFAIP3和HMOX1。

然而，尽管使用了强效的免疫抑制方案，猪心脏异种移植的人类病例中仍出现了抗体介导排斥的迹象。最近的肾异种移植病例也显示出细胞性排斥的早期迹象，需要类固醇和抗胸腺细胞球蛋白治疗。同样，在移植到脑死亡人体内的六基因编辑猪的肝脏中观察到了补体、IgM和IgG沉积。最后，在为期61天的猪到人遗体胸腺肾移植中，观察到了CD8⁺ T细胞的强劲克隆扩增以及γδ T细胞和NK细胞的共同参与。这些结果强调了需要替代的免疫抑制方案。

除了猪的基因工程外，还应探索补充策略来控制排斥反应，促进异种移植耐受。针对免疫耐受中枢机制的胸腺移植和混合造血嵌合体在临床前模型和最近的3期随机临床试验中均显示出有希望的结果。 Alternatively, 基于调节性T细胞（Treg）的疗法可能代表一种有前途的策略，通过调节体液和细胞反应来增强异种移植物的外周耐受。因此，它们在各种异种移植模型中的持久存在与长期移植物存活相关。Treg是具有数十种内置抑制功能的免疫细胞，可分为不同亚群，其中特征最明确的是胸腺来源的天然表达转录因子Foxp3的Treg。重要的是，Foxp3⁺ Treg可以很容易地使用细胞表面表达标志物（CD4⁺CD127^lowCD25^high）进行纯化，在体外扩增，并回输给患者。

本综述旨在总结同种移植中Treg过继细胞疗法（ACT）的经验教训，更新异种移植Treg研究的最新进展，并讨论人源化猪表达人白细胞抗原（HLA）以重定向下一代Treg疗法用于异种移植并提高其疗效的基本原理。

2 Methods

在ClinicalTrials.gov上使用了以下术语进行搜索，确定了53项试验，其中26项被选中。根据一项已发表的研究，增加了一项试验（NCT04950842）。从ISRCTN注册库中纳入两项试验（ISRCTN11038572, ISRCTN15374803），从UMIN-CTR注册库中纳入一项（UMIN000015789）。关于异种移植中Treg疗法的文献，在PubMed上使用与Treg和异种移植相关的术语（排除肿瘤学相关关键词）进行搜索（2010-2025年），检索到22篇文章，其中8篇直接涉及异种移植Treg疗法的研究文章被选中。

3 Lessons learnt from allotransplantation

在设计异种移植的Treg疗法之前，必须考虑已从同种移植中学到的经验教训。截至2025年6月26日，已注册了30项试验：16项涉及肾脏，8项肝脏，4项胰岛，2项心脏移植受者。治疗产品包括多克隆（即非特异性扩增）Treg（20项试验）、供体同种抗原反应性（dar，即在供体来源的B细胞存在下扩增）Treg（8项试验）和嵌合抗原受体（CAR，即用病毒载体工程化改造）Treg（2项试验）。值得注意的是，一项测试多克隆Treg用于猪胰岛异种移植的临床试验（NCT03162237）于2013年在中国启动。

3.1 Autologous Treg injection is feasible and safe

多项研究证实了自体Treg疗法的可行性和安全性。在ONE研究中，总共28名活体肾移植患者接受了自体Treg输注，这些Treg或是多特异性的（非特异性刺激），或是供体同种抗原反应性的（dar）。两种类型的Treg输注均耐受良好且被认为是安全的。在肾移植中，另外两项研究（TRACT试验和TASK研究）也证实了这种方法的安全性和可行性。这在肝移植中也得到了ThRIL试验和ARTEMIS试验的证实。西班牙的THYTECH试验评估了从胸腺组织分离的Treg（thyTreg）用于儿童心脏移植。在所有报告中，Treg并未对器官功能产生负面影响，证实该疗法可考虑用于异种移植。

3.2 Persistence of autologous Tregs

Treg疗法的一个担忧是其有限的持久性，因为大多数细胞在输注后会丢失。在TASK研究中，氘标记的葡萄糖显示，输注的Treg持久水平相似，在输注后第一周占循环Treg的2-8%，三个月时占0.2%。在非Treg亚群中未检测到氘，表明谱系稳定。肾脏活检显示，浸润的CD4⁺ T细胞中有0.5–5.9%表达Foxp3，但只有0.2%带有氘标记。在ARTEMIS试验中，氘标记的darTreg持久性与剂量相关。相比之下，TRACT和ThRIL试验未标记输注的Treg。TRACT显示在整个一年的随访期间循环Treg持续增加5至20倍，而ThRIL报告仅在输注较高剂量后的第一个月出现短暂的1.2-1.5倍增加。总之，即使一部分Treg可以在长期免疫抑制患者中持续存在，异种移植可能需要重复的Treg输注。

3.3 Treg manufacturing, a challenge

Treg的制造仍然困难，主要有两个原因。首先，长期的免疫抑制方案损害了细胞的适应性，限制了其体外扩增能力。其次，darTreg在移植后也可能离开循环，在开始Treg分离时减少了循环同种异体细胞的库存在。在ARTEMIS试验中，九次扩增中有四次未能达到最低可输注剂量，这归因于肝移植受者外周血中Treg计数低。deLTA试验部分因制造困难而提前终止。在ONE研究中，四个制备无法给药，三个是因为细胞数量不足，一个是因为细菌污染。观察到细胞体外扩增能力的高度变异性。在ThRIL试验中，十一次Treg扩增中有两次失败，一次可能由于起始Treg计数低，另一次由于最终产品纯度不足（46% CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞）。总体而言，同种异体来源（例如，来自胸腺或脐带血）的Treg可能更适合异种移植，特别是如果设想多次输注。

3.4 Efficacy of polyclonal and donor-reactive Tregs

临床疗效的最佳原理证明已在干细胞移植后预防移植物抗宿主病（GvHD）中观察到。在器官移植中，尽管注册试验数量众多，但Treg疗法迄今显示的结果不太令人印象深刻。在ONE研究中，52.2%接受多克隆Treg的患者成功停用霉酚酸酯并维持他克莫司单药治疗。尽管活检证实的急性排斥反应率保持稳定，但与历史对照相比，感染风险显著降低。目前正在英国招募的IIb期TWO研究旨在通过评估其对活检证实的急性排斥反应的影响以及减轻免疫抑制负担来验证多克隆Treg的疗效。在ARTEMIS试验中，主要疗效终点是钙调神经磷酸酶抑制剂剂量减少75%且肝功能测试稳定至少12周。在五名可以用darTreg治疗的患者中，两名达到了主要终点；人数太少无法得出疗效结论。因此，可以预期多克隆或异种反应性Treg产品的益处有限，这应鼓励使用合成受体改造Treg。

3.5 Anti-HLA-A2 CAR Tregs in clinical trials

在用于富集Treg同种反应性的不同策略中，临床前模型中最有效的方式是使用识别仅在移植器官中表达的HLA分子的CAR。考虑到HLA-A2在普通人群中的高流行率，研究最多的CAR是针对HLA-A*02:01（A2）的。在临床前模型中，A2-CAR Treg在GvHD以及皮肤、胰岛和心脏移植模型中显示出优于其他方式的疗效，具有增强的迁移和抑制活性。这些结果导致启动了两项测试A2-CAR Treg的临床试验，对象是接受来自HLA-A2阳性供体的肾脏（STEADFAST试验）或肝脏（LIBERATE试验）的HLA-A2阴性受者。已有少数患者移植并接受了A2-CAR Treg剂量治疗。在治疗后的肝脏活检中发现了A2-CAR Treg，且未报告治疗相关的不良事件。

4 Tregs in xenotransplantation: what’s new?

自从我们首次回顾证明扩增异种特异性Treg可行性的早期研究（实现了高达3500倍的扩增）以来，又发表了一些报告，尽管该领域的总体文献仍然稀少。体外，异种抗原刺激的Treg在异种混合淋巴细胞反应（MLR）中显示出比多克隆对应物更强的抑制功能。Jin等人证实，猪反应性人Treg在保护新生猪胰岛细胞团（NICC）方面比多克隆Treg更具抑制性，存活时间超过84天，而非特异性多克隆Treg为63天。不出所料，CD27⁺（一种活化和记忆Treg标志物）与Foxp3、细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和Helios的高表达相关，并在猪皮肤异种移植小鼠模型中与超过60天的保护相关。Duong等人表明，长期异种移植物存活与狒狒Treg中CD39的表达相关，这代表了识别Foxp3^high抑制性Treg的另一个潜在生物标志物。重要的是，人Treg产生的IL-10对于体外抑制异种效应T细胞增殖至关重要，并且对于延长NICC体内存活时间也至关重要，因为用抗人IL-10单克隆抗体阻断该细胞因子显著缩短了异种移植物的存活时间。

在非人灵长类动物（NHP）模型中，五只猴子移植了猪胰岛异种移植物，均接受了眼镜蛇毒因子（以消耗补体）、抗胸腺细胞球蛋白用于诱导治疗，以及抗CD154单克隆抗体和低剂量西罗莫司用于维持治疗。三只NHP在围移植期输注了自体多克隆Treg。五只NHP中，两只保持胰岛素独立超过500天，且两者都接受了Treg。然而，在停止免疫抑制后，这两只NHP并未维持耐受。在这些动物中，自身抗体滴度与血糖控制丧失以及胰岛活检中密集的CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润相关，表明过继转移的Treg不足以诱导持久的移植耐受。在免疫抑制撤除后重复输注Treg是否能带来更好的结果仍有待确定。有趣的是，可检测到的循环CD4⁺CD25^highFoxp3⁺ Treg的持续存在与猪到NHP心脏异种移植的长期存活相关。在该模型中，Treg水平在排斥发生前一直保持升高，因此也可能代表监测移植物存活的生物标志物。

5 Next-generation xenograft-specific Tregs

T细胞基因编辑的最新进展为开发用于异种移植的下一代Treg疗法开辟了新机遇。循环中的抗原特异性Treg很少，并且在免疫抑制患者的外周血中难以扩增。使用慢病毒或逆转录病毒载体用合成基因重定向Treg的特异性可以规避这些限制。在这方面，可以设计两种类型的受体：T细胞受体（TCR）和CAR。TCR是生理性受体，而CAR是人工免疫跨膜受体，由抗原结合域（通常是来自抗体的单链可变片段scFv）、铰链区、跨膜域和细胞内信号域组成。CAR相对于TCR的主要优势是其能够识别任何细胞表面、基质或多价可溶性抗原。相反，TCR靶向主要组织相容性复合体（在人类中称为HLA，在猪中称为SLA）。虽然尚无TCR工程化Treg和CAR工程化Treg之间的直接比较，但最近的一项研究表明，在GvHD小鼠模型中，接受A2-CAR Treg治疗的组比接受多克隆或darTreg的组具有显著的生存优势。因此，CAR构成了一种有吸引力的方式，可以重定向T细胞对抗更广泛的组织或细胞特异性抗原。TCR和CAR都可以识别参与抗原呈递和免疫识别的HLA或SLA系统，因此可用于武装用于异种移植的Treg。

6 Perspectives for Treg therapy in xenotransplantation

在异种移植中，由于受体细胞和猪供体都可以进行基因改造，可以设想几种方法，要么通过重定向人Treg对抗使用现有猪的SLA，要么通过进一步改造猪表达HLA。在2022年国际移植学会大会上，报道了抗SLA*0401 CAR Treg在人性化小鼠模型中对猪皮肤和胰岛异种移植物的保护作用。另一种策略是生成HLA-A2转基因猪细胞。这样做的主要优点是可与经过临床测试的A2-CAR Treg兼容。然而，只有HLA-A2阴性受体可以使用这种方法治疗。此外，在猪组织上表达HLA也可能增加猪源性肽的呈递，从而增加免疫原性和排斥风险。

为了解决这两个问题，可以用肽-HLA（pHLA）三聚体复合物改造猪。在这种配置中，选择在胸腺中自然呈递的免疫显性肽（例如，源自胰岛素）将（1）防止由于胸腺阴性选择而发育出自身“异种”反应性T细胞库的风险，（2）阻断异种移植物中HLA-A2分子上异种肽的呈递，（3）设计特定的TCR或CAR。同一头猪可用于A2阴性受体的CAR Treg疗法和A2阳性患者的TCR工程化（eTCR）Treg疗法。

另一种策略可能涉及工程化异种反应性Treg（对抗SLA）。不幸的是，据我们所知，SLA特异性人TCR尚未公开。这可以通过对最近排斥移植物的患者进行高通量单细胞TCR测序来解决。 Alternatively, 在细胞培养中扩增SLA反应性Treg也可能是TCR发现的材料来源。无论如何，在设计TCR时，存在TCR与内源性链错配的重要风险。这种担忧将需要碱基编辑CRISPR技术。

6.1 Removing SLA to create a favorable environment for Treg suppression

为了增加Treg的免疫监视能力，通过降低SLA I类表达和/或移除SLA II类来降低猪的免疫原性仍然很重要。然而，完全删除B2M会缩短猪的寿命，受影响动物在大约四周龄时出现发热并死于败血症，尸检时观察到多器官淋巴结肿大和细菌浸润。为了解决这个问题，在德国产生了三基因修饰猪（B2M, GGTA1, CMAH），具有SLA I类^low表型，仅引入了B2M基因的部分缺失。这些动物仍然存活，并显示出降低的免疫原性，表现为体外人类外周血单核细胞（PBMC）增殖降低。考虑到与人b2m的密切同源性，如果可溶性人b2m会恢复某些SLA表达，则这种方法可能仍然有限。B2M KO对铁稳态的功能影响可能是另一个限制。

除了B2M KO猪，还通过靶向CIITA基因成功产生了SLA II类缺陷猪。四基因KO（GGTA1, CMAH, β4GalNT2, CIITA）猪存活超过一年，并在混合淋巴细胞反应中显示CD4⁺ T细胞增殖减少。也产生了SLA I类和II类缺陷猪。与之前的报告一致，动物的存活受到损害，这需要净化设施和高标准程序，如剖腹产和繁殖。因此，缺少SLA会损害T细胞和NK细胞的适应性。

7 Conclusion

转基因猪已成功改造以下调对异种移植物的免疫反应。它们可以进一步人源化并表达HLA分子。这将能够特异性招募工程化的CAR或TCR Treg，这些Treg将是转基因特异性的。通过强制呈递自身来源的肽，我们可以进一步防止呈递猪源性肽的风险。从这个角度来看，HLA-A2可能是一个很好的候选者，因为它在普通人群中流行率高，并且有大量关于A2-CAR Treg的临床前结果。表达额外的HLA-E和HLA-G分子（已知与自然杀伤（NK）细胞和T细胞上表达的抑制性受体结合）可以进一步有助于建立异种移植耐受。在已经SLA I类缺陷或 alternatively CIITA KO SLA II类缺陷的动物中改造这些HLA，可能是未来最好地保护异种移植物的最有效策略。

虽然Treg疗法仍在同种移植中进行评估，但异种移植独特的免疫环境提供了一个研究Treg归巢到移植物能力的机会，最终减少免疫抑制负担。它们的疗效应在NHP异种移植模型中得到证实，包括使用重复输注，理想情况下来自同种异体来源。