益生菌Bacillus sonorensis PMC204来源的膜囊泡通过激活自噬通路对抗耐药结核分枝杆菌的治疗潜力研究

为解决多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核病治疗难题，研究人员开展新型益生菌Bacillus sonorensis PMC204及其膜囊泡(MVs)的抗结核活性研究。研究发现PMC204及其MVs能显著抑制结核分枝杆菌H37Rv和XDR菌株，并揭示其作用与自噬激活和flagellin蛋白密切相关。该研究为 microbiome therapeutics领域提供了创新性治疗策略。

　　

结核病至今仍是全球最严重的公共卫生威胁之一，尤其随着多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核分枝杆菌的流行，传统治疗方案正面临严峻挑战。据世界卫生组织报告，2023年全球约四分之一人口感染结核菌，而COVID-19大流行更加剧了结核病诊断和治疗的困难。现有抗结核药物开发缓慢，面对泛耐药菌株的出现，临床迫切需要创新治疗策略。在这一背景下， microbiome-based therapeutics（微生物组疗法）作为新兴领域，为抗结核治疗提供了新思路。益生菌作为活的微生物，通过调节宿主免疫和抑制病原菌生长，展现出对抗感染性疾病的巨大潜力。

在这项发表于《Medical Microbiology and Immunology》的研究中，来自Soonchunhyang大学医学院的研究团队通过系统性筛选，从传统韩国发酵食品Cheonggukjang中分离出一株新型益生菌——Bacillus sonorensis PMC204，并深入探索了其抗结核活性及作用机制。研究发现，该菌及其衍生的膜囊泡(membrane vesicles, MVs)能有效抑制结核分枝杆菌标准株H37Rv和XDR临床分离株，其效果甚至优于一线药物异烟肼(isoniazid, INH)和利福平(rifampicin, RIF)。进一步机制研究表明，PMC204的抗结核作用与自噬(autophagy)激活密切相关，且其膜囊泡中富含的flagellin蛋白可能是发挥免疫调节功能的关键成分。安全性评价显示，PMC204无细胞毒性和急性口服毒性，具备良好的临床转化前景。该研究不仅为抗结核药物研发提供了新候选，也拓展了下一代益生菌(next-generation probiotics)在治疗耐药菌感染中的应用价值。

研究人员采用了几项关键技术开展本研究：首先通过16S rRNA测序和全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)鉴定菌株分类和基因组特征；利用透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)表征MVs的形态和浓度；采用蛋白质组学(proteomic analysis)解析MVs的蛋白质组成；通过共聚焦显微镜(confocal microscopy)和CFU测定评估细胞内抗结核活性；以实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测自噬相关基因表达；最后通过细胞毒性试验和动物重复给药实验进行安全评价。所有结核菌实验均在ABSL-3实验室（韩国疾病管理厅认证：KDCA-20-3-04）完成，菌株来源包括ATCC标准株和韩国结核菌资源库(KMRC)的XDR临床分离株。

筛选具有抗结核活性的益生菌菌株

研究人员从56株益生菌中初步筛选出PMC204，该菌在浓度5×10⁶ CFU/mL时显示出最强的抗结核活性且无细胞毒性。共聚焦显微镜显示，经PMC204处理的感染GFP-H37Ra的巨噬细胞中绿色荧光信号显著减弱，表明细菌存活率降低。通过比较不同浓度提取物的效果，进一步确认PMC204在1×10⁷ CFU/mL时对结核菌的抑制率超过85%。

PMC204菌株的鉴定与基因组特征

通过16S rRNA序列分析和全基因组测序，PMC204被鉴定为Bacillus sonorensis。其基因组大小为4,827,387 bp，GC含量45.1%，编码4,880个CDS（clustering of orthologous groups）。比较基因组学显示，PMC204在基因组大小、GC含量和基因数量上与其他B. sonorensis菌株存在明显差异，表明其为一株新颖的益生菌候选者。

PMC204的抗结核效果

PMC204提取物对H37Rv和XDR结核菌均表现出剂量依赖性抑制。在1×10⁷ CFU/mL浓度下，对H37Rv的抑制率达86%，对XDR菌株的抑制率超过89%。相比之下，异烟肼(INH)在25μg/mL时对XDR菌株的抑制率仅为83.6%。通过抗酸染色(AFB staining)和CFU计数进一步证实，PMC204能显著降低巨噬细胞内的细菌载量。

PMC204来源膜囊泡(MVs)的分离与抗结核活性

研究人员从PMC204培养上清中分离出MVs，经TEM和NTA表征，其平均粒径为165.2 nm，浓度为8.46×10⁸ particles/mL。这些MVs在9×10⁶ particles/mL浓度下对XDR结核菌的抑制率高达92%，优于PMC204粗提物（77.8%）和高浓度INH（86%）。研究表明MVs的抗结核活性具有剂量依赖性，在2.5×10⁷ particles/mL时抑制率接近99%。

PMC204来源MVs的蛋白质组学分析

蛋白质组学分析鉴定出186种常见蛋白质，其中flagellin、肽聚糖内切酶CwlO和自溶素抑制剂IseA等蛋白丰度较高。KEGG通路分析显示这些蛋白质主要参与肽聚糖生物合成、鞭毛组装、核糖体功能和RNA聚合酶活性等生物学过程。STRING蛋白互作网络表明这些蛋白具有高度的功能关联性，提示MVs可能通过多组分协同发挥抗结核作用。

PMC204诱导自噬的作用

研究显示PMC204能剂量依赖性地诱导巨噬细胞中酸性囊泡细胞器(AVOs)的形成，并上调自噬相关基因(ATG5、ATG7、ATG12和ATG16)的表达。共聚焦显微镜观察和荧光定量分析表明，PMC204处理组的自噬水平与异烟肼和吡嗪酰胺处理组相当，提示自噬激活可能是其抗结核机制的重要组成部分。

PMC204的安全性评价

细胞毒性试验显示，即使在最高测试浓度(1×10⁷ CFU/mL)下，PMC204对RAW264.7巨噬细胞也无毒性作用，反而促进细胞增殖。动物实验表明，经口给予豚鼠和小鼠PMC204两周后，未观察到临床异常症状、死亡或体重减轻，证明其具有良好的安全性。

研究的结论与意义

本研究系统阐明了Bacillus sonorensis PMC204及其膜囊泡通过激活自噬通路和免疫调节机制对抗耐药结核病的治疗潜力。研究发现：（1）PMC204能有效抑制MDR和XDR结核分枝杆菌，其活性优于传统抗结核药物；（2）PMC204衍生的MVs富含flagellin等免疫活性蛋白，通过TLR5信号通路可能参与自噬激活和免疫调节；（3）蛋白质组学分析揭示了MVs中多种功能蛋白的协同作用；（4）安全性评价支持PMC204作为治疗剂的临床转化潜力。

该研究的创新性在于首次报道了Bacillus sonorensis来源的MVs具有抗结核活性，并初步阐明了其通过自噬机制发挥作用。这些发现不仅为耐药结核病的治疗提供了新策略，也拓展了下一代益生菌和微生物组疗法在抗感染领域的应用。随着REBYOTA等微生物组疗法获得FDA批准，PMC204有望成为结核病治疗领域的创新生物制剂。未来研究应进一步开展体内药效评价和临床前研究，推动其向临床应用转化。

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