DREB/ERF家族DNA结合景观的多样性：聚焦高杂合基因组果树的生殖过程

本文系统解析了荔枝DREB/ERF转录因子家族的DNA结合特性，通过DAP-seq技术揭示其亚家族特异性结合基序（DREB: C(G/A)CCG(A/C)C; ERF: CGCCG(C/T)C），发现LITCHI017494通过激活LcTPS基因调控萜类合成，并首次阐明单核苷酸多态性（SNP）通过改变结合效率调控开花时间的分子机制，为复杂基因组作物的转录调控研究提供了重要资源。

　　

引言

转录因子（TFs）在植物基因组中占比超过5%，以超大家族形式存在并执行特异性调控功能。DREB/ERF家族作为AP2/EREBP超家族中最大的植物特异性TF家族，包含DREB（脱水响应元件结合蛋白）和ERF（乙烯响应因子）两个主要亚家族。系统发育学上可进一步划分为10组（DREB I-IV组和ERF V-X组）或12组（DREB A-1至A-6组和ERF B-1至B-6组）。DREB和ERF亚家族识别相似但略有差异的序列：ERF主要结合典型GCC-box元件（5′-AGCCGCC-3′），而DREB特异性结合DRE顺式元件（5′-A/GCCGAC-3′）和类似C-repeat元件（TGGCCGAC）。AP2结构域中第14和19位氨基酸残基是决定结合特异性的关键，DREB中为缬氨酸（V）和谷氨酸（E），ERF中为丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），这种差异影响蛋白与DRE或GCC-box的互作能力。

DREB/ERF转录因子在胁迫响应、植物生长和发育过程中调控大量基因。例如小麦TaSRL1通过生长素途径抑制根生长，拟南芥ERF1通过抑制FT转录负调控开花时间，ENO通过调节CLV-WUS信号级联中的WUS表达调控花分生组织大小。此外，ERF还参与花青素、类胡萝卜素和辣椒素等次生代谢物的合成调控。

尽管ERF研究广泛，但全球尺度的结合位点图谱仅在模式植物拟南芥中有过全面解析。与一年生草本植物相比，多年生木本植物具有更复杂的生殖生物学过程（包括多年生开花周期和复杂的物候模式），且转录因子结合位点常受单核苷酸多态性（SNP）影响，在高杂合度木本植物中单倍型特异性SNP变异可能直接改变结合效率，这些层面在遗传同质的自交拟南芥系中无法观察到。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）作为东南亚本土具有高经济价值的多年生果树，具有高度杂合的基因组，包含早花和晚花两种主要单倍型，是研究复杂生殖器官发育转录调控机制的理想材料。近期研究强调ERF/DREB转录因子在开花、果实发育和着色等过程中的重要作用，亟需在该物种中鉴定和表征这些因子的转录调控功能和生物学作用。

DREB/ERF转录因子在荔枝中的序列和结构比较分析

通过同源基因比较和手动基因结构注释审查，鉴定出95个具有完整蛋白编码序列的DREB/ERF家族成员。系统发育分析将其分为两个主要亚家族（DREB和ERF），进一步划分为10个 distinct组别：DREB亚家族包含39个成员（4组），ERF亚家族包含56个成员（6组）。所有成员均包含单个AP2结构域，DREB蛋白在比对位置15为缬氨酸（V），位置20为可变氨基酸（其中23个为谷氨酸E）；而ERF蛋白在对应位置为保守的丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），但V组例外（与DREB相似，位置15为V，位置20可变）。蛋白折叠预测显示DREB成员核心结构为两个α-螺旋和三个β-折叠，ERF成员（除V组外）核心结构为一个α-螺旋和三个β-折叠，其余结构元件（如α-螺旋）变异较大。这些序列和结构差异表明DREB和ERF亚家族可能具有不同的DNA结合特性和生物学调控功能。基于同源性的基因功能注释表明荔枝DREB/ERF基因可能调控胁迫响应、生长发育、代谢和植物激素信号传导等生物学过程，且这些功能在不同组间存在差异。

荔枝DREB/ERF转录因子的结合位点偏好性

为探究序列和结构差异是否影响转录调控功能，成功构建并测序了45个代表性荔枝DREB/ERF成员的DAP-seq文库（覆盖所有10个组）。DREB/ERF家族表现出强DNA结合能力，共识别65,194个结合位点（包括45个成员共享的698个核心峰）。DREB和ERF亚家族结合位点数相当（分别为42,748和46,701），核心结合位点数分别为1,199和1,180。不同组间结合位点数差异显著（3,309-39,041），IX、II和I组结合能力最强。两亚家族主要结合基因外显子和基因间区域，位置偏好性一致，但结合位点重叠率仅约50%（包括核心结合位点），表明两亚家族DNA结合位点存在明显序列差异。

所有DREB/ERF倾向于结合含7-bp核心CCG基序的序列，但两亚家族核心基序不同：DREB为C(G/A)CCG(A/C)C，ERF为CGCCG(C/T)C。与ERF相比，DREB在基序第2位具有显著G/A变异性，第6位主要为A碱基；ERF核心基序第2位为保守G碱基，第6位为可变C/T碱基，这与其它物种报道一致。值得注意的是，属于ERF亚家族的V组三个成员（LITCHI030961、LITCHI016618和LITCHI016922）在核心基序第2位表现出与DREB相似的A/G变异性（第6位模式与ERF亚家族一致），其核心基序与DREB亚家族一致，表明尽管系统发育分类属于ERF，但其结合和调控模式更类似于DREB亚家族成员。

DREB/ERF潜在靶基因集的比较分析

共鉴定出23,973个DREB/ERF潜在调控基因，其中185个核心靶基因被所有45个成员共同靶向。DREB和ERF亚家族分别结合20,953和20,309个潜在靶基因（核心靶基因数分别为279和1,326）。不同组别靶基因数差异显著（3,433-19,005），II、IX和III组靶基因数最多。下游靶基因在不同亚家族或组间变异度高，10组间结合位点相关性分析显示显著差异（1-Jaccard指数>0.5），这可能源于各组核心基序的变异。尽管不同组间结合位点重叠率低，但潜在下游靶基因重叠率相对较高（1-Jaccard指数<0.5），同一亚家族组间更为明显。值得注意的是，与ERF亚家族其它组相比，V组靶基因与DREB亚家族更为接近，表明其生物学调控功能可能类似于DREB成员。

GO富集分析表明DREB/ERF调控多种关键生物学过程，包括植物激素（如乙烯）响应、营养和生殖生长发育、信号转导、代谢和胁迫响应等。不同亚家族间生物学调控功能存在差异，而同一亚家族组间趋向一致。此外，荔枝DREB/ERF显著结合多个AP2超家族成员（如参与花器官分化和胚珠种皮发育的AP2、胚胎与营养阶段发育转换关键的AIL5、茉莉酸响应中负调控防御基因表达的ERF4、细胞分裂素响应调控胚胎子叶叶片发育的CRF）的基因区域或候选调控区域，且亚家族和组间呈现 distinct结合模式。

DREB/ERF在荔枝生殖发育中的广泛作用

生殖发育（包括花和果实发育）是影响荔枝生产的关键生物学过程。通过整合DAP-seq数据集和公开RNA-seq数据，鉴定出在生殖发育中可能起重要作用的DREB/ERF及其下游调控网络和潜在生物学功能。对荔枝五个器官（叶、花、种子、果皮和假种皮）不同发育阶段的转录组分析发现众多具有高水平或组织特异性表达模式的关键DREB/ERF成员。

低温处理（模拟春化）叶片中关键DREB/ERF表达水平普遍降低，这部分成员可能在荔枝开花负调控中起作用。在雄性和功能性雄花的雌蕊和雄蕊中，大多数关键DREB/ERF高表达；而LITCHI008991b、LITCHI029903和LITCHI029147在雌花雌蕊中高表达。种子发育过程中大多数关键DREB/ERF在早期高表达；在果皮和假种皮发育中，大多数关键DREB/ERF表达呈上升趋势，表明DREB/ERF可能主要起正调控荔枝果皮和假种皮发育的作用。

在可能参与五个主要生殖发育过程（开花、花性别分化、种子发育、果皮发育和假种皮发育）的关键DREB/ERF中，完成DAP-seq测序的成员数分别为16、19、16、22和10。六个DREB/ERF（LITCHI017494、LITCHI007962、LITCHI008991a、LITCHI029903、LITCHI014444和LITCHI013895）在五个生殖发育过程中均呈现高表达水平和显著表达趋势变化，表明这些因子可能是荔枝生殖发育的重要调控因子。整合DAP-seq和RNA-seq数据发现众多在DAP-seq中可能被DREB/ERF调控且与DREB/ERF呈现明显共表达模式的基因，表明这些基因可能在转录水平被直接调控。GO和KEGG富集分析显示这六个DREB/ERF的下游共表达靶基因富集于多个与荔枝花果实发育密切相关的生物学过程和通路，包括花发育、次生代谢途径、胚胎发育和碳水化合物代谢等。其中，通过系统发育分析、表达谱和靶基因集功能富集综合筛选发现一个有趣基因LITCHI017494（属于II组，功能关联萜烯合成和开花途径），作为代表性案例用于探究DREB/ERF转录因子在荔枝生长发育中的功能。

LITCHI017494调控荔枝假种皮中倍半萜类生物合成

香气是荔枝果实的重要品质性状，假种皮中芳香化合物主要由萜烯构成。研究发现荔枝DREB/ERF调控假种皮中倍半萜类生物合成。萜烯合酶（TPS）是萜类化合物生物合成中的关键酶。DAP-seq和RNA-seq整合分析发现LITCHI017494是荔枝假种皮中高表达且同时靶向三个串联重复LcTPSs（LcTPSa1、LcTPSa2和LcTPSa3）第一外显子的DREB/ERF成员，表明LITCHI017494蛋白可能特异性结合该外显子区域。三个LcTPSs的CDS序列和蛋白功能域高度一致，表明其蛋白功能相似。EMSA实验证实GST-LITCHI017494蛋白能结合LcTPSs第一外显子中的预测特异性基序（突变该基序后结合消失，添加竞争性冷探针后结合条带减弱）。酵母单杂（Y1H）实验进一步证实LITCHI017494能直接结合LcTPSs第一外显子。双荧光素酶报告实验支持LITCHI017494激活LcTPSs转录。如预测所示，LITCHI017494定位于细胞核，发挥转录因子功能。

此外，LITCHI017494和LcTPSs表达水平变化趋势一致，随着假种皮发育成熟显著增加（LcTPSa2和LcTPSa1表达水平远高于LcTPSa3，表明它们是主导TPS基因）。这些结果表明LITCHI017494可能通过上调LcTPSs表达促进假种皮中萜类生物合成。

为确认LITCHI017494功能并鉴定LcTPSa2生物合成化合物，在烟草叶片中异源表达LITCHI017494和LcTPSa2。气相色谱-质谱（GC-MS）分析显示LcTPSa2生物合成产物为法尼醇（荔枝香气主要成分之一），且LITCHI017494促进LcTPSa2的法尼醇生物合成。综上，LITCHI017494通过上调三个串联重复LcTPSs的转录和表达促进荔枝假种皮中倍半萜类化合物法尼醇的生物合成，从而可能影响荔枝假种皮香气形成。

DREB/ERF在荔枝不同成熟期两种单倍型基因组中的差异作用

荔枝品种'妃子笑'（FZX）呈现两种基因组单倍型：早熟和晚熟，表明它们的花期调控途径存在差异。鉴于DREB/ERF可能在荔枝开花中起重要作用，通过分析代表不同成熟期的两种单倍型中DREB/ERF基因调控来检验其与成熟期的关联。在HH单倍型（晚熟）和HY单倍型（早熟）间，不同DREB/ERF亚家族和组别结合的靶基因数总体一致，但与未分离单倍型的参考基因组相比，鉴定出的靶基因数显著减少。一致性分析显示同一组内两种单倍型间结合基因集存在显著差异（基因集差异度0.34-0.44）。

结合基因的GO富集分析表明同一组内基因在两种单倍型间呈现不同的生物学过程富集，这些差异与多个重要生物学过程密切相关（包括分生组织转换、花器官发育、代谢调控、胁迫响应、信号转导和乙烯信号响应）。值得注意的是，分生组织转换与荔枝开花直接相关（直接影响成熟期）。这些结果表明荔枝DREB/ERF在两种单倍型间的基因结合和调控存在显著差异，且与荔枝成熟期相关。

进一步筛选两种单倍型间荔枝DREB/ERF差异调控的开花基因，鉴定出两个重要候选基因LcSVP和LcVOZ（均呈现LITCHI017494在HH和HY单倍型间的差异结合）。LcSVP是荔枝中已知的开花负调控因子，其功能已被研究证实：在第九外显子中，SNP使LITCHI017494结合位点7-bp核心基序第1位从HH单倍型的A变为HY单倍型的T，导致LITCHI017494特异性结合HH单倍型LcSVP（不与HY单倍型结合）。LcVOZ是AtVOZ1直系同源物（通过下调FLC表达和上调FT表达促进开花）：在第一外显子中，SNP使LITCHI017494结合位点7-bp核心基序第3位A变为C（区分HH和HY单倍型），LITCHI017494特异性结合HY单倍型LcVOZ。这些差异结合事件经EMSA实验进一步证实。荧光素酶实验还表明LITCHI017494显著上调HH.LcSVP和HY.LcVOZ表达。

67个不同成熟期荔枝品种冬季叶片转录组分析显示，随着品种成熟期延迟，LITCHI017494表达水平增加；相应地，HH.LcSVP表达呈上升趋势，HY.LcVOZ表达呈下降趋势。群体基因分型分析表明晚熟品种更可能纯合HH.LcSVP，早熟品种更可能纯合HY.LcVOZ。晚熟品种中开花抑制因子HH.LcSVP高表达、早熟品种中开花促进因子HY.LcVOZ高表达，这与品种基因型和成熟期特征相符（LcSVP在转录水平效应更为明显）。

综上推测LITCHI017494是调控荔枝成熟期的重要候选基因。下游基因LcSVP和LcVOZ结合位点核心基序的单碱基突变导致LITCHI017494特异性上调晚熟单倍型中LcSVP（可能延迟开花导致晚熟），并特异性上调早熟单倍型中LcVOZ（可能促进开花导致早熟）。

讨论

基因复制后的亚功能化和/或新功能化被认为是植物多样化和适应不同环境条件的关键途径。探究不同家族成员间的DNA结合特异性为了解遗传冗余和多样性提供了宝贵见解。每个ERF蛋白的DNA结合特性主要由其DNA结合域（DBDs）结构决定，这种一级结构组成很大程度上决定了每个ERF与DNA的互作方式，塑造其结合特异性和调控功能。ERF家族内的系统发育分类超越分类学分组，可能反映DNA结合特性（特定ERF亚组倾向于呈现相似结合谱和功能作用）。

在荔枝中，DREB成员核心结构包含两个α-螺旋和三链β-折叠，ERF成员核心结构包含单个α-螺旋和三链β-折叠（与拟南芥中对应物相似）。通常同一亚家族内基因呈现更保守的结构和功能，但ERF V组的蛋白结构和核心结合基序与DREB亚家族密切对应（表明其结合调控模式类似于DREB成员），这种现象在拟南芥中也有观察到。该结果可能源于DREB与ERF的进化关系（DREB通过基因复制和后续扩增从ERF起源），因此V组可能代表ERF和DREB间的过渡形式（AP2结构域核心第15和20位氨基酸与DREB更为接近）。

本研究通过DAP-seq为45个代表性荔枝DREB/ERF成员分析了下游转录靶点（每个组至少选择一个）。尽管组间代表性不完全平衡，但该集合捕获了广泛的系统发育多样性并反映了花果实发育期间的表达。组内靶点谱一致：每组最强结合剂的峰和基因结合相关性模式与合并所有可用成员获得的结果高度匹配。同一组内成员还共享更相似的结合基序，且组内结合事件变异低于组间变异，表明组内结合更为保守。因此这些下游结合谱为荔枝DREB/ERF基因调控网络（特别是在花果实发育背景下的作用）提供了可靠覆盖。

近期研究证实ERF/DREB转录因子是植物生长