综述：基于类器官的抗肿瘤药物筛选新技术

本综述系统阐述了类器官（Organoids）技术在抗肿瘤药物筛选中的前沿应用，重点介绍了其与基因编辑（CRISPR/Cas9）、高通量筛选（HTS）、人工智能（AI）、微流控及3D生物打印等新兴技术的融合策略。文章深入探讨了类器官共培养、气液界面（ALI）培养等技术在模拟肿瘤微环境（TME）及免疫治疗（如CAR-T、PD-1抑制剂）筛选中的优势与挑战，为肿瘤精准医疗提供了创新模型和转化前景。

　　

2 基于类器官的新兴抗肿瘤药物筛选技术

2.1 类器官与新型培养技术的结合

类器官是由干细胞或祖细胞在体外培养中分化形成的微型三维（3D）器官模型，能高度模拟体内器官的生理结构和功能。2009年，Hans Clevers实验室利用Lgr5⁺干细胞成功培养出首个肠道类器官，此后该技术被《自然·方法》评为2017年度技术。目前，结肠、小肠、胃、肺、乳腺、肝、脑、肾、前列腺等多种类器官已成功构建。

在肿瘤免疫治疗领域，类器官共培养技术通过将患者来源的肿瘤类器官与免疫细胞（如树突状细胞DC、肿瘤相关巨噬细胞TAM、癌症相关成纤维细胞CAF、外周血单核细胞PBMC、CAR-T细胞等）共培养，直接评估免疫治疗药物的杀伤效果及对免疫系统的调控作用。例如，Hubrecht类器官技术平台开发了类器官-T细胞共培养系统，能再现亲本组织的分子异质性和功能特性，为癌症免疫治疗开发和验证提供了强大策略。

气液界面（ALI）培养技术通过将肿瘤组织切片嵌入凝胶并置于透性支持物上，上表面暴露于空气，底部浸没培养液，形成气液界面。这种结构无需外源补充免疫细胞即可维持肿瘤微环境中天然免疫细胞和成纤维基质的组成，保留肿瘤的病理特征和遗传背景。研究发现，ALI培养的类器官可模拟生长在同系免疫活性宿主中的肿瘤上皮细胞，并包含T、B、NK细胞和巨噬细胞等天然免疫细胞，在体外模型中展示了免疫检查点的功能性抑制。

微流控技术通过动态流体流动和高通量集成，克服了传统类器官培养的局限性。微流控系统可实现周期性流体流速、营养浓度、氧和二氧化碳分压的动态变化，并集成传感器、泵、阀等功能模块，实时监测和调控类器官生长过程。例如，多层微流控芯片可实现间充质基质细胞（MSC）、PBMC与肝细胞癌（HCC）患者来源类器官（PDO）的共培养，成功模拟天然TME，支持单核/巨噬细胞存活和M2巨噬细胞分化，为抗HCC免疫治疗的高通量药物筛选提供了有效实验模型。

2.2 类器官与基因编辑技术的整合

CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于精确修饰类器官中的特定基因，构建具有特定遗传特征的肿瘤类器官模型，为研究肿瘤发生和药物靶点提供强大工具。例如，研究人员利用CRISPR/Cas9将胆管癌常见的四种突变（TP53、PTEN、SMAD4和NF1）引入人类肝脏类器官，研究去泛素酶BAP1在胆管癌中的功能，发现BAP1通过调控染色质凝聚控制上皮细胞特性。

在克服耐药性方面，基因编辑技术可构建具有特定耐药突变的类器官模型，以理解耐药机制并提供新的治疗靶点。例如，通过CRISPR/Cas9技术构建KRAS突变结直肠癌类器官，发现KRAS突变与靶向治疗耐药性之间存在强相关性；在胰腺导管癌类器官中引入KRAS^G12D、Tp53^R172H和SMAD4缺失等耐药基因，并进行6000种化合物的广泛筛选，可观察类器官对不同抗肿瘤药物敏感性的变化，为克服耐药性提供新治疗方向。

2.3 类器官技术与高通量药物筛选平台的协同

高通量药物筛选平台显著提高了类器官药物筛选的准确性和效率。例如，基于人类卵巢癌类器官的高通量药物筛选系统可在384孔板和1536孔板上进行大规模药物筛选，定量高通量筛选44420种不同药用化学可处理支架和386种药理活性小分子化合物，大大提高了卵巢癌药物筛选效率。

实时监测技术结合高内涵成像、荧光分析系统和细胞代谢评估，可在高通量筛选中实时监测药物处理期间肿瘤类器官的复杂表型变化。例如，集成3D培养室、流体控制系统、定制软件和活细胞成像技术的系统，可并行测试多个类器官的单药或药物组合治疗，并提供类器官的连续实时成像，为研究药物反应提供动态数据。

2.4 类器官技术与人工智能和机器学习算法的融合

人工智能和机器学习算法可对数千张图像进行深入分析，有效评估类器官活性或分类类器官亚型，广泛应用于抗肿瘤药物筛选。例如，Phindr3D无监督数据驱动图像分析算法可实现基于体素的特征学习，对3D成像数据进行自动表型定量分析；CancerCellNet机器学习计算工具可确定癌症模型与22种天然肿瘤类型和36种亚型之间的相似性，快速评估肿瘤模型的转录保真度。

在动态捕获方面，AI算法可实现类器官的实时监测和快速数据收集分析，优化筛选过程。例如，基于图像的高内涵分析方法利用计算机视觉和机器学习，在多个时间点稳健、无创地追踪不同患者样本来源类器官对伊立替康和奥沙利铂的7天动态反应；OrBITS自动活细胞图像分析软件可动态监测类器官，筛选当前用于肺癌和胰腺癌的药物，确定最佳参数和药物反应指标。

在药物敏感性预测方面，AI通过分析大量类器官药物筛选数据，可识别生物标志物并预测药物敏感性和疗效，揭示潜在药物靶点和作用机制。例如，Cellos精确高通量模型分析了约10万个类器官和235万个细胞，通过分析染色或荧光标记核的细胞片段准确分类类器官内不同标记细胞群，再现细胞对复杂药物敏感性的传统发光反应，定量分析治疗引起的类器官和核形态变化。

AI技术还可用于构建虚拟类器官模型，模拟药物对不同肿瘤类型的影响，用于药物筛选和预测。例如，人工诱导全脑类器官平台NEUBOrg构建了虚拟异染性脑白质营养不良（MLD）全脑类器官模型，测试了861种单药和两药组合对该类器官模型的影响，提出了几种两药组合作为潜在治疗替代方案。

2.5 类器官与3D生物打印技术的融合

3D生物打印技术在精确构建复杂3D结构方面具有显著优势，可定制具有特定孔隙度、硬度和生化特性的支架，为类器官生长创造更接近生理条件的环境。例如，藻酸盐/明胶/基质胶水凝胶组成的培养基质可有效维持患者来源胃腺癌细胞的培养，延长患者来源肿瘤球的培养时间而不影响细胞活力或破坏肿瘤球形成；浸没生物打印方法将类器官生物打印到孔板内的透明质酸（HA）支架中，使类器官的体积和几何形状更接近体内自然形态。

定制化筛选平台通过整合3D生物打印和肿瘤类器官技术，为构建定制化药物筛选平台提供了新可能性，可同时打印多个微型结构，用不同药物浓度或组合处理，实现定制化药物筛选。例如，集成高速活细胞干涉测量（HSLCI）和机器学习的生物打印技术可对数千个类器官进行准确、无标记的并行质量测量，确定类器官对特定治疗的短暂或持久敏感性或耐药性；创新复合生物墨水可培养结直肠癌类器官，模仿近生理组织生长环境，展示优异的光交联特性，实现稳定凝胶结构的快速形成。

3 类器官在抗肿瘤药物筛选中的应用挑战与前景

3.1 现有挑战

类器官培养存在标准化协议和评估标准缺乏的问题，影响类器官培养的可靠性和可重复性；长期培养和传代可能改变其生物学特性，正常细胞的遗传稳定性会降低肿瘤类器官的纯度；肿瘤异质性等因素会影响肿瘤类器官的药物筛选结果。类器官结构、空间分布和大小对药物功效的影响也不容忽视，与单细胞衍生类器官相比，3D类器官的药效显著降低；支架的存在会延迟药物作用时间；增加类器官体积易导致中心细胞死亡，越靠近核心的细胞药物反应发生越晚。

在重现复杂TME方面，类器官仍缺乏血管和神经等体内成分，与免疫细胞共培养及维持免疫细胞活性和功能存在技术挑战；TME的不稳定性限制了类器官在筛选免疫检查点抑制剂（ICI）和抗血管生成药物中的应用。例如，NK细胞浸润到肿瘤中是抗肿瘤免疫的关键步骤，受趋化因子信号（如CXCL12、CX3CL1）和通过ICAM-1、VCAM-1等分子与内皮细胞粘附的严格调控，当前类器官共培养系统缺乏这种结构化血管系统和由此产生的趋化因子梯度，可能低估基于NK细胞的疗法或依赖这些迁移机制的双特异性抗体的功效。

在监管和伦理方面，从患者肿瘤组织培养类器官涉及确保患者知情同意、保护患者隐私及正确使用患者组织样本等问题；类器官的应用可能引发一些社会和伦理争议，如类器官的身份、权利和地位问题。

3.2 未来展望

未来类器官培养技术和条件有望在多个方面进一步标准化：培养基组成可更精确模拟体内TME，包括更广泛的生长因子、ECM成分和免疫细胞；培养方法可进一步优化，如建立动态培养系统模拟体内血流和机械刺激；应建立统一的类器官质量评价标准。

跨学科合作对于推进类器官技术至关重要，生物学、医学、材料科学和工程等学科的整合可为类器官技术的进步带来新机遇。例如，类器官技术与材料科学的整合可开发更适合类器官生长的生物材料支架，提供更好的物理支持和生长环境；与工程技术的整合可实现自动化、高通量类器官培养和药物筛选平台的设计。

在临床转化应用方面，未来可建立大规模PDO库，收集不同类型肿瘤患者的类器官样本，为药物研发和临床治疗提供丰富资源；利用类器官库进行药物筛选有望快速识别新的抗肿瘤药物和治疗靶点；类器官可用于监测肿瘤治疗效果和耐药性的出现，实现动态个性化治疗；类器官实验可与临床试验结合，为药物临床研究提供更可靠的实验证据。

4 总结

类器官在抗肿瘤药物筛选研究中展现出巨大潜力，不同类器官构建策略提供了高度模拟体内TME的平台，为肿瘤免疫治疗药物筛选奠定了坚实基础。类器官技术与基因编辑、高通量筛选、人工智能和3D生物打印等新兴技术的融合，催生了更高效、准确和个性化的抗肿瘤药物筛选方法。尽管类器官研究目前在标准化培养方法和维持TME完整性方面面临许多挑战，但随着未来技术进步、创新和多学科合作，类器官有望成为抗肿瘤药物研发和临床治疗的重要工具，为人类对抗癌症做出巨大贡献。