新型纳米生物偶联物介导的质粒递送系统在细菌遗传工程中的突破性应用：从基因组编辑到环境修复

本综述系统介绍了磁铁矿/银-pDMAEMA-PEG-BUFII纳米生物偶联物作为先进质粒递送系统的开发与应用（CRISPR/Cas9）。该系统在四大挑战性场景中展现卓越性能：革兰氏阳性菌基因组编辑、抗生素耐药性（AR）控制、大质粒（>40kb）递送以及复杂环境（如土壤）中的转化效率。通过功能化修饰（pDMAEMA增强质粒负载，PEG化提升稳定性），该技术克服了传统方法（转化、接合、转导）的效率限制，为医学、工业和环境领域的细菌遗传工程提供了创新解决方案。其磁性特性还支持纳米颗粒回收利用，降低环境影响。

　　

纳米颗粒表征

研究团队通过多步功能化制备了磁铁矿/银-pDMAEMA-PEG-BUFII纳米生物偶联物，并系统表征了其理化性质。动态光散射（DLS）显示，裸磁铁矿纳米颗粒的平均流体动力学直径为111.8纳米，形成银壳后增至224纳米，多分散指数（PDI）从0.12升至0.37，表明尺寸分布变异性增加。pDMAEMA偶联后直径调整为187.4纳米（PDI=0.26），硅烷化进一步修饰至192.87纳米（PDI=0.22），最终功能化产物直径降至168.9纳米（PDI=0.19），呈现更均匀的颗粒分布。热重分析（TGA）证实有机组分牢固附着，初始重量损失（9.16%）归因于松散结合有机物，440°C以上13.64%的损失对应pDMAEMA、PEG和BUFII分解。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在3390 cm^-1（C-H伸缩）、2857 cm^-1（主链C-H）、1740 cm^-1（C=O）和1428 cm^-1（N(CH₃)₂变形）处显示特征峰，验证pDMAEMA连接；1641 cm^-1（酰胺I）、1377 cm^-1（N-C键）和1255 cm^-1（酰胺II）确认BUFII存在；1000 cm^-1（Si-O）和950 cm^-1（Fe-O）峰分别源自硅烷化和磁铁矿核。这些特性表明纳米颗粒具备适合细菌细胞内在化的尺寸（<500纳米）和稳定性，为高效质粒递送奠定基础。

质粒递送用于CRISPR/Cas在革兰阳性链霉菌JH010中的应用

在革兰阳性模型菌株链霉菌JH010中，传统接合方法仅获得一个抗安普霉素外接合子，效率极低（0.02 CFU/μL），尽管测试了多种参数（接合培养基、抗生素浓度、孢子数量）。相比之下，纳米生物偶联物实现了20.66 ng质粒DNA/mg纳米颗粒的负载，转化细胞浓度达1.65 CFU/μL，效率比接合方法高82倍。CRISPR/Cas9系统成功编辑tatC基因，测序显示在PAM序列附近插入两个嘌呤碱基（AG），导致移码突变。突变体生长缓慢，孢子颜色从野生型的灰色变为白色，表明双精氨酸转运（Tat）途径失活引发多效表型，与变铅青链霉菌和疮痂病链霉菌ΔtatC突变体的报道一致。这些结果证明纳米生物偶联物能有效绕过革兰阳性菌厚壁障碍，实现高效质粒递送和基因组编辑。

质粒递送用于CRISPR/Cas介导的抗生素耐药性大肠杆菌控制

在革兰阴性模型大肠杆菌10-beta中，纳米生物偶联物用于递送靶向bla_KPC基因的CRISPR/Cas9系统（质粒约10 kb）。与化学感受态细胞转化相比，纳米颗粒递送质粒的效率平均高71%（以氯霉素抗性细胞与总细胞比率衡量），且结果更一致（标准差低）。CRISPR/Cas9的基因组编辑效率也从感受态细胞的70%提升至87%，成功使对亚胺培南耐药的菌株再敏感化。机制上，纳米颗粒通过pDMAEMA的静电吸引、BUFII的膜穿透和pH响应性DNA释放实现高效递送，克服了噬菌体（宿主特异性）、接合（低频率）和电转化（环境限制）等传统方法的局限。磁性核心还允许环境中的纳米颗粒回收和潜在再利用，减少生态影响。

大质粒向大肠杆菌的递送

研究评估了纳米生物偶联物递送大约40 kb fosmid的能力。使用化学感受态EPI300细胞未检测到转化子（氯霉素抗性），而阳性对照pUC19（小质粒）转化成功，确认细胞感受态。纳米颗粒递送平均产生72转化子/μL，效率1.34 × 10^-6（±8.11 × 10^-7），与CRISPR质粒递送效率相当（1.7 × 10⁵转化子/μg DNA对7.2 × 10⁴转化子/μg DNA）。传统化学转化对小质粒（2.5 kb）效率可达10⁸转化子/μg DNA，但大构建体即使电转化也困难。纳米生物偶联物无需特定宿主、噬菌体或接合，简化了工作流程，拓宽了应用范围。

土壤中质粒递送

在无菌土壤样品中，比较了纳米生物偶联物与化学感受态细胞对pUC19质粒的递送效率（氨苄青霉素抗性选择）。纳米颗粒递送获得11.3 CFU/μL转化子，比感受态细胞（0.05 CFU/μL）高两个数量级，但低于液体系统，表明土壤基质降低细胞存活率。结果存在重要差异（重复间变异），提示环境因素（如土壤水分、温度）影响效率。尽管接合可能在优化条件下实现更广泛传播，但纳米颗粒为土壤生物修复（如质粒生物增强）提供了替代方案，需进一步研究原生种群对质粒的获取和catabolic基因表达。

讨论

本研究证明磁铁矿/银-pDMAEMA-PEG-BUFII纳米生物偶联物在四大挑战性应用中显著优于传统方法：革兰阳性菌基因组编辑、CRISPR/Cas9抗生素耐药性控制、大质粒递送和土壤等复杂环境中的转化。纳米颗粒的流体力学特性、PDI和热稳定性通过功能化步骤优化，尺寸低于500纳米，适合细胞摄取。在链霉菌JH010中，纳米颗粒克服物种特异性接合障碍，实现高效质粒递送和CRISPR编辑，突变体表型与Tat途径失活一致。在大肠杆菌中，纳米颗粒递送CRISPR系统效率高且一致，再敏感化效果佳，为抗生素耐药性控制（如肠道微生物组或废水处理厂）提供新平台。大质粒递送无需噬菌体或接合，效率虽低于小质粒，但避免Cas9毒性等问题。土壤中递送效率提升表明环境应用潜力，但需优化条件。总体而言，纳米生物偶联物提供通用、宿主非依赖性质粒递送平台，未来研究应聚焦配方优化、规模化、体内行为评估及其他核酸（如RNA或蛋白质）递送，拓展其在遗传工程中的作用。