合成细胞表面锚定IL-2恢复冷冻NK细胞杀伤功能：突破免疫治疗保存瓶颈的新策略

本研究揭示了冷冻保存显著削弱NK细胞在3D环境中的迁移与细胞毒性功能，而通过与活化T细胞短期共培养可有效恢复其功能。关键机制依赖于NK-T细胞直接接触及局部高浓度IL-2信号传递。研究进一步开发出表面锚定IL-2的合成细胞，可高效、可控地增强冷冻后NK细胞（包括CAR-NK）的细胞毒性，为推进“即用型”NK细胞免疫治疗提供了创新性解决方案。

　　

2.1 T细胞共培养显著加速NK细胞杀伤动力学

自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的关键效应细胞，负责识别和清除肿瘤细胞。基于NK细胞的过继免疫疗法日益受到关注，但冷冻保存这一细胞储存标准技术会显著削弱NK细胞的细胞毒性，尤其在生理性3D环境中更为明显。研究发现，与效应T细胞进行短期共培养可显著增强NK细胞运动性和杀伤功能。仅需1天共培养即可恢复冷冻受损的NK细胞在3D环境中的功能。该增强效应需要T细胞与NK细胞直接接触，从而在细胞接触部位形成局部高浓度IL-2。

2.2 活化T细胞共培养大幅增强NK细胞运动性

为探究T细胞共培养诱导NK细胞功能增强的具体机制，研究团队通过质谱流式细胞术（CyTOF）结合流式细胞分析，同步检测了35种表面与胞内标志物。结果显示，与T细胞共培养后，NK细胞中活化标志CD69、IL-2受体α链（CD25）与γ链（CD132）、趋化因子受体CD185/CXCR5以及黏附分子CD54/ICAM-1表达显著上调，而穿孔素（perforin）和颗粒酶B（granzyme B）水平则有所下降。

在3D胶原基质中，通过光片显微镜观察发现，经T细胞共培养的NK细胞运动速度和迁移持续性显著提高，高运动性（速度>2 μm/min）细胞比例大幅增加，平均平方位移（MSD）升高，转向角减小。此外，共培养NK细胞表现出更强的基质浸润能力。RNA测序分析表明，细胞骨架组织和微管细胞骨架相关基因表达发生显著变化，其中肌球蛋白轻链12A（MYL12A）、肌球蛋白1F（MYO1F）和肌球蛋白1G（MYO1G）等肌球蛋白亚基表达改变尤为突出。肌球蛋白活性受到肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和Rho关联蛋白激酶（ROCK）的空间调控，抑制MLCK或ROCK均显著削弱了T细胞增强的NK细胞浸润能力。

2.3 T细胞共培养恢复冷冻保存受损的NK细胞杀伤效率

在3D杀伤实验中，嵌入胶原基质中的K562-pCasper靶细胞与经T细胞共培养后的NK细胞共孵育。活细胞成像显示，共培养NK细胞较早启动杀伤，24小时内即可通过凋亡和坏死清除绝大部分肿瘤细胞，而未增强的NK细胞未能有效控制肿瘤细胞增殖。值得注意的是，该策略同样可恢复冷冻保存后NK细胞的功能损伤。将冻存NK细胞与活化T细胞共培养24小时后，其细胞毒性及运动性均得到显著恢复。

2.4 NK与T细胞间的物理接触通过IL-2信号增强NK细胞功能

研究通过Transwell实验发现，仅有可溶性细胞因子而无直接接触时，NK细胞杀伤增强效应大幅减弱。使用巴利昔单抗（basiliximab）阻断IL-2受体α链（CD25）可完全消除T细胞介导的NK细胞功能增强。然而，直接添加高浓度重组IL-2（50 ng/mL）却无法复制共培养带来的强化效应，说明局部高浓度IL-2而非全身性扩散的细胞因子才是功能增强的关键。免疫染色显示，内源性IL-2聚集于NK-T细胞接触部位，其密度显著高于随机分布区域。

2.5 表面呈递IL-2的合成细胞有效增强NK细胞杀伤效率

为模拟T细胞表面IL-2的局部呈递，研究团队开发了硅核脂质双层包被的合成细胞，并将重组IL-2共价连接于脂质表面。结果显示，与表面锚定IL-2的合成细胞共培养24小时后，NK细胞在3D环境中的杀伤效率显著提升，且与T细胞共培养效果相当。该效应具有剂量依赖性，而未包被IL-2的合成细胞无此效果。

研究还比较了IL-15的效果：虽然可溶性IL-15可增强NK细胞杀伤，但其效果仍低于T细胞共培养组。而表面呈递IL-15的合成细胞则能够达到与IL-2合成细胞类似的增强效果。在冷冻保存的CD19-CAR-NK细胞中，IL-2或IL-15合成细胞均能显著恢复其针对CD19⁺ TMD8淋巴瘤细胞的细胞毒性。即便经过二次冻融，合成细胞仍可有效恢复CAR-NK细胞功能。

3 讨论

本研究系统阐明了T细胞通过直接接触和局部IL-2信号增强NK细胞运动性与细胞毒性的新机制，并创新性地提出利用合成细胞表面锚定IL-2的策略，有效解决冷冻保存导致的NK细胞功能损伤问题。该研究为推进标准化、可规模化的“即用型”NK免疫治疗提供了重要技术路径和理论依据。