叶酸缺乏通过DNA双链断裂介导三维基因组紊乱导致神经管畸形的机制研究

本综述系统阐述了叶酸缺乏如何通过诱导DNA双链断裂（DSBs），破坏三维基因组空间结构（如染色质环、TADs），进而导致神经管闭合相关基因（如Zeb1、Ascl1、Sox6）表达异常，最终引发神经管缺陷（NTDs）的分子机制。研究整合Hi-C、ChIP-seq、CRISPR/Cas9等多组学技术，首次揭示DSBs与三维基因组互作在NTDs发生中的关键作用，为NTDs的预防和靶向干预提供了新思路。

　　

1 引言

神经管缺陷（NTDs）是全球范围内最常见的严重出生缺陷之一，其病因是妊娠早期神经管闭合失败。孕妇叶酸缺乏显著增加NTDs发生风险，但其潜在病因和机制仍不明确。近年来，染色体构象捕获技术（如Hi-C）为解析染色质三维结构提供了新视角，揭示了三维基因组组织结构在基因表达调控中的关键作用。DNA双链断裂（DSBs）作为最严重的DNA损伤类型，严重影响基因组稳定性，并可能通过影响三维基因组组织参与疾病发生。叶酸作为一碳单位供体，通过影响DNA甲基化等表观遗传修饰参与基因调控。叶酸缺乏导致的一碳代谢紊乱会引起基因组不稳定性和染色体断裂，但其与NTDs易感性的潜在关联尚未探索。

2 结果

2.1 叶酸缺乏诱导的NTD小鼠负载DSBs并与三维基因组组织破坏相关

研究采用甲氨蝶呤（MTX）构建NTD小鼠模型，MTX作为二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，竞争性抑制DHFR活性，破坏一碳代谢。在神经管闭合阶段（E9.5天），NTD小鼠胚胎表现出典型的脊柱裂和无脑畸形表型。通过RNA测序（RNA-seq）和Hi-C技术分析小鼠脑和脊髓组织，基因集富集分析（GSEA）显示差异表达基因（DEGs）主要与区域化、RNA聚合酶II（Pol II）转录调控区序列特异性DNA结合以及发育过程相关。利用Peakachu进行染色质环调用，发现NTD脑组织中丢失3430个环，获得2382个环；脊髓组织中丢失4645个环，获得1783个环。染色体构象捕获（3C）实验验证了环的变化。值得注意的是，染色质环改变一致性地发生在小鼠胚胎干细胞（mESCs）和NTD组织的相同基因组区域。

研究发现，转录因子编码基因Zeb1和Ascl1均涉及染色质环变化。Zeb1是先前研究中报道的562个神经管闭合相关基因之一，调控神经祖细胞分裂的 cleavage plane 方向、神经元极性和迁移，并促进非同源末端连接DSB修复。Ascl1诱导小鼠成纤维细胞生成功能性多巴胺能神经元，积极参与神经干细胞和祖细胞活动。在NTDs中，Zeb1和Ascl1的表达变化与染色质环改变一致。RT-qPCR和Western blotting实验证实了细胞模型和NTD组织中Zeb1和Ascl1的异常表达。免疫组化结果同样显示NTD小鼠脑中Zeb1和Ascl1的相同变化。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术删除Zeb1和Ascl1位点增强子环锚定的基因组区域，证实染色质环变化对Zeb1和Ascl1表达的关键调控作用。

基因本体（GO）通路分析显示，差异环中基因显著富集于DNA修复通路，表明NTD进展中发生了DNA损伤和缺陷性DNA修复。粘连蛋白介导环挤出，CTCF介导染色质环和自相互作用的拓扑关联结构域（TADs）形成。粘连蛋白复合物是组织三维基因组的重要结构蛋白，为DSB修复所必需。免疫荧光染色检测E9.5 NTD胚胎中粘连蛋白亚基RAD21和DNA损伤标志物gH2AX的表达，发现与对照组相比，NTD小鼠脑和脊髓异常神经系统中RAD21显著富集且伴有DSBs，表明叶酸缺乏诱导的负载DSBs的NTD小鼠与三维基因组组织破坏相关。

2.2 活性基因中发生的DSBs导致叶酸缺乏下三维基因组中Pol II停滞和R环形成

R环可作为Pol II停滞在DNA损伤修复过程中的中间体，R环的异常积累会阻碍复制叉进展。考虑到染色质由粘连蛋白和CTCF组织成环和自相互作用单元TADs，DSBs如何影响叶酸缺乏下的环和TAD组织仍未知。ESCs的染色质构象与发育组织一致。研究先前已在mESCs中使用MTX通过DSB富集工作流程鉴定了DSB景观，MTX已被认为是NTDs的风险因素。mESCs用0.12 μM MTX处理24小时，细胞内叶酸水平显著低于未处理mESC。RNA-seq显示DEG主要集中于组织发育、细胞生长和DNA损伤应答。值得注意的是，神经管闭合相关基因在mESCs和组织中大多差异表达，表明MTX处理的mESCs可作为NTD分析的细胞模型。

对正常和MTX处理的mESC进行高分辨率Hi-C测序，A/B区室比较显示MTX处理后三维基因组的基本结构特征大多未变，与小鼠NTDs中观察一致。在mESCs中，受MTX处理影响的A/B区室占整个基因组的很小比例（<5%）。基于A/B区室变化，将基因组分为四种类型：稳定A、A转B、B转A和稳定B区域。mESCs和组织间的A/B区室动态显示小鼠组织中的大部分基因组区域从胚胎期保留。有趣的是，通过检查基因表达，发现与其他区域相比，DEGs显著富集在稳定A区域。

随后检查了MTX处理和对照样本中DSB比率与基因表达在TAD水平的关系。较高水平的TADs与活性基因表达增加相关。随着TAD层级增加，DSB比率和基因转录活性逐渐增加。在TAD背景下分析时，观察到基因转录、DSBs和TAD水平之间的清晰相关性。

研究确实显示增加的TAD与MTX处理下的DSB比率以及转录活性相关。随后使用Peakachu鉴定mESCs中的染色质环，发现MTX处理后丢失4486个环，获得5075个环。比较了mESCs、小鼠脑和脊髓在有或无MTX处理下的染色质环变化，以及这些变化在mESCs和小鼠组织中的保守性。只有一小部分染色质环变化在mESCs和小鼠组织中保守。有趣的是，大多数神经管闭合相关基因位于这些保守且改变的染色质环区域，使得MTX处理的mESC成为研究NTDs的可靠模型。

同时，鉴定出6787个DSB与MTX处理mESC中差异环锚点重叠，表明改变的环更可能富集在DSB区域。出现超过一次的环锚点被指定为“繁忙锚点”，作为染色质互作的枢纽，其他则分类为“正常锚点”。比较分析显示，就特定染色质环锚点按锚点活动分类的普遍性而言，MTX处理后具有繁忙锚点的环的位移比具有正常锚点的环更显著。这支持了我们的假设，即具有高染色质接触频率的染色体区域更容易发生叶酸缺乏诱导的破坏，从而导致染色质环的显著变化。

2.3 叶酸缺乏诱导的DSBs在基因组中的特征

由于DSBs与神经管发育的三维基因组特征相关，我们想知道具有DSBs的区域是否容易形成新环导致基因失调。为了验证这一点，首先使用Break Labeling in situ直接映射DSBs并对mESC进行测序。MTX处理后DSB富集水平增加，与叶酸缺乏诱导的NTD小鼠中观察一致。组蛋白标记的存在和性质传统上用于识别表观遗传特征，如增强子、启动子以及开放和关闭染色质。为了确定mESCs中诱导的DSBs分布，在MTX处理的mESCs中进行ChIP-seq，使用ChromHMM对染色质状态进行分类。基于所选染色质标记的组合模式，基因组区域被分为10种不同的染色质状态。标记为低染色质信号的两种状态被排除在下游分析之外。距离分析显示，标记为转录起始位点（TSSs）的基因组区域，包括TssA、TssWk1和TssWk2，非常接近TSSs。

为了更好理解组蛋白修饰与DSB在染色质中的作用，在正常和MTX处理的mESCs中进行ATAC-seq实验。结果显示正常mESCs中大部分ATAC-seq峰与ENCODE项目中mESCs的DNase I超敏感位点（DHSs）重叠。此外，在TSSs周围检测到 distinct ATAC-seq信号。

为了消除内源性DSBs的影响，计算了DSB比率作为MTX处理和正常mESCs中每个基因组区域DSB富集的 fold change。结果显示mESCs在MTX处理后经历DSB富集的显著增加，全基因组平均增加约28.5倍。而且，TSS附近诱导的DSBs富集高于基因间区域和其他区域。基因组区域的DSB比率与基因TSS的距离负相关，DSB比率在TSS附近极高。

基因启动子和增强子的正常功能对细胞内的协调转录至关重要。接下来关注了MTX处理后这些位置的DNA断裂。计算了十种不同染色质状态中TssAs和EnhAs的数量。进行的相关分析显示，位于基因组区域的TssAs和EnhAs的比例与这些区域的DSB比率正相关。还在每个DSB分裂区域类别中识别了TssA相关基因，并使用DAVID进行GO分析。位于具有最高DSB比率的基因组区域的TssA相关基因与基本生物功能相关，如mRNA加工、RNA剪接和DNA复制。这些基因也与DNA修复和细胞对DNA损伤刺激的反应功能相关，表明脆弱的活性启动子影响细胞中的基本过程，也可能在DNA修复中活跃。使用GREAT对具有最高DSB比率的2291个活性增强子进行GO分析显示，1837个基因与这些活性增强子和生物过程相关，如细胞骨架依赖的细胞内运输、细胞对白血病抑制因子的反应以及细胞-基质粘附。接下来，将附近20 kb上下游有TssAs的EnhAs识别为近端EnhAs，而缺乏此类区域TssAs的识别为远端EnhAs。进行的比较分析表明，近端和远端EnhAs的DSB比率显著高于没有EnhAs的区域。

重复序列由转座元件和简单重复组成，广泛分布于小鼠和人类基因组中。在先前研究中，长散在核元件1（LINE1或L1）和基因组DNA的低甲基化与NTDs风险增加相关。发现MTX诱导的DSBs分布与重复元件的不同重复亚型相关。DSBs与长散在核元件2（LINE2或L2）重复正相关，与L1重复负相关。DSBs与SINEs内的多个重复和低复杂性重复序列正相关。对于长末端重复（LTRs），DSBs与gypsy重复正相关，与ERV1和ERVK重复反相关。此外，比较分析显示，具有ATAC-seq或ChIP-seq峰（H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3）的基因组区域的DSB富集显著高于没有峰的区域，无论是MTX处理的mESCs还是正常mESCs。这些结果表明，DSBs在叶酸缺乏期间优先发生在表观遗传修饰富集区域。

2.4 DSB相关的染色质环失调发生在神经管闭合相关基因中

为了确定DSB相关的染色质环失调是否影响基因表达，分析了mESC中改变的环锚点和差异基因的重叠。共有43个差异基因富集在差异环锚点中。随后对这43个基因进行GO通路分析，发现它们显著富集在神经管发育通路中。具体而言，Hoxa1和Rgma调控神经管形态发生过程中的定向细胞分裂、细胞形状和微管动力学。Sox6和Nrg1调控新皮质发育中的背侧祖细胞身份和中间神经元多样性。Baiap2、Plk2和Nrg1与树突棘发育相关，而Rgma和Nrg1富集于轴突再生的调控。此外，Plk5、Baiap2、Rgma和Nrg1可能参与神经元投射发育的正向调控。Rgma和Nrg1也在调控神经元投射再生中发挥重要作用。另外，Baiap2、Fgfbp3和Nrg1调控神经系统发育。

为了更好理解染色质环功能与基因表达的关系，检查了位于mESCs染色质环交叉点的组蛋白标记。Sox6是编码转录因子的重要基因，在中枢神经系统发育中起关键作用。结果显示在NTDs中Sox6下调，且Sox6处有一个带有H3K27me3信号的环。RT-qPCR证实了细胞模型和NTD组织中Sox6的异常表达。通过CRISPR/Cas9基因编辑删除Sox6位点附近DSB热点处的差异环，证实染色质环变化对Sox6表达水平改变的直接原因。Sox6表达失调阻碍祖细胞的分子分离和皮质中间神经元的分化。Adamtsl5和Plk5对细胞外微纤维的形成和神经元的发育至关重要，在NTDs背景下转录增加。这些改变可能与带有H3K27me3信号的染色质环丢失相关。相比之下，阻遏物Trim66的表达减少似乎与带有H3K27ac信号的染色质环丢失相关。

DSBs是转录过程中维持DNA三维构象的内在组件。基因组组织影响DSBs形成的位点以及连接形成SVs的位点对。为了评估这一点，使用Eagle C对Hi-C数据进行分析，分析mESC、脑和脊髓中MTX处理诱导的新SVs。结果显示MTX处理显著增加了mESC中的染色体易位。此外，基因表达的显著变化似乎与附近的结构变化相关。例如，基因Dpp6已被报道影响神经元兴奋性和可塑性。叶酸缺乏诱导的DSBs染色体倒位导致mESC中Dpp6基因的截断。此外，在小鼠脊髓中观察到SVs与其表达变化之间的相关性。观察到在Gm20707和Gm49083基因组区域中与NTDs相关的显著染色体倒位，这可能解释其表达增加。

2.5 人类NTDs中神经管闭合相关基因的失调与DSB相关的染色质环相关

评估了八种不同基因定义之间的重叠程度，以探索神经管闭合相关基因的失调与DSB相关的染色质环及其表达之间的潜在相关性。分析显示，DSBs和染色质环的改变对基因表达有直接且显著的影响。为了在人类NTDs中验证这些，从NTDs婴儿脑中选择并分析了560个神经管闭合相关基因中的90个显著差异基因，使用NanoString，并使用了五种选择性基因注释方法研究它们的重叠。在检查的基因中，12个表现出DSBs和染色质环的改变。值得注意的是，这12个基因在人类NTDs胎儿脑中表现出表达变化，且先前与NTDs相关。

为了测量叶酸缺乏诱导的DSBs对NTD基因重新连接环互作调控的影响，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术通过锚定代表性差异环删除具有最高DSB比率的基因组区域在Ift122上，这是上述识别的12个基因之一。设计了三个sgRNA靶点。sgRNA1和sgRNA2靶向具有DSB热点的Ift122位点的远端启动子-增强子环，而sgRNA3靶向没有DSB热点的Ift122位点的近端启动子-增强子环。首先，在小鼠胚胎成纤维细胞的三个生物学重复中证实了Ift122位点的启动子-增强子环。Sanger测序证实了单细胞衍生克隆中的纯合删除。CRISPR/Cas9对Ift122的敲除使用3C实验证实。靶向sgRNA1和sgRNA2后，发现单细胞克隆1和2中Ift122 RNA表达显著增加，与NTDs胎儿样本中NanoString nCounter assay结果一致。位于环外的两个基因（Alox5和Cand2）的mRNA水平没有变化。靶向sgRNA3后，与对照组相比，单细胞克隆中Ift122 RNA表达没有变化。此外，使用MTX处理的单细胞克隆进行RT-qPCR。再次，Ift122在MTX处理后表达水平高于靶向sgRNA1和sgRNA2的单细胞克隆。Alox5和Cand2 mRNA表达在MTX处理后没有显著变化。这表明靶向Ift122的DSB相关染色质环失调的完整性对其表达至关重要。Axin2作为12个识别基因之一，也被验证在NTD小鼠模型中与DSB相关的染色质环失调。通过sgRNA靶点靶向Axin2位点附近DSB热点的染色质环变化调控了Axin2的表达。总之，这些数据表明叶酸缺乏诱导的环锚点处DSBs有助于神经管闭合相关基因的错误表达。

3 讨论

叶酸和其他B族维生素在表观遗传调控中起关键作用。叶酸相关的表观遗传标记已被提出作为叶酸水平与各种疾病结果（如NTDs）之间关联的合理机制。动物模型对于研究NTDs和胚胎发生过程中管闭合失败导致的严重先天畸形至关重要。使用小鼠、鸡、非洲爪蟾和斑马鱼等动物模型，研究人员已成功构建许多NTD模型以研究神经管闭合失败的潜在机制。可遗传操作的小鼠被广泛用于通过化学诱导（如视黄酸暴露、叶酸拮抗剂、丙戊酸和高血糖）或基因敲除（如Pax3和Sox2突变）来模拟人类NTDs，如脊柱裂。DHFR是叶酸代谢中的关键酶。它催化叶酸和二氢叶酸的还原，这是激活氧化形式叶酸的唯一途径。在本研究中，向怀孕小鼠注射了MTX，一种DHFR的特异性抑制剂。

我们先前研究揭示，一碳代谢的破坏导致基因组不稳定性和染色体断裂增加与叶酸缺乏。然而，在理解染色体断裂与NTD表型之间的关系方面仍存在 gap。过去已提出几种捕获染色体断裂的方法。例如，使用DNA损伤标志物gH2AX通过ChIP-seq检测吡哆胺诱导的DNA损伤。单核苷酸分辨率DSB识别也可使用DSB Capture验证。基于脉冲场凝胶电泳（PFGE）的方法用于检测含有DNA复制位点的DSB片段。所有这些方法提供了在各种条件下识别DSBs的强大方式；然而，DSBs水平的定量评估及其生物学意义很少被提及，仍值得关注。然而，关于叶酸缺乏下基因组、表观遗传和基因表达互作的变化是否导致基因失调，从而异常神经管发育的问题仍然存在。大多数已发表的NTDs遗传研究专注于来自叶酸代谢途径或在小鼠NTD模型中识别的神经管闭合相关基因。而且，没有已发表的大规模GWAS或表观遗传研究专注于神经管闭合相关基因。因此，需要进一步的高通量测序，使用Hi-C等方法，以扩展发现神经管闭合相关基因的动态转录特征。

大多数TADs在不同细胞类型和物种中不变，表明它们作为基因组的基本功能单元。我们分析了患者NTDs神经组织中560个神经管闭合相关基因的表达。其中一些基因已被确认与神经管闭合相关。约83%的DEGs由DSB基因结构和3D染色质组织的改变引起。特别是，几乎一半的这些基因同时受DSB改变和3D染色质结构的影响，表明DSB形成有助于参与神经发育基因失调的3D染色质结构破坏。此外，我们表征了剩余一半受3D染色质结构修饰影响的神经管闭合相关基因。我们的CRISPRi和锚点删除结果也表明，与近端基因非编码区敲低相比，低叶酸诱导的此类结构域动态通过促进远端基因非编码区的增强子-启动子接触改变了基因调控的精确性。所有这些因素与3D染色质结构在转录调控中更复杂的作用一致，这可能是参与NTDs的转录变化的先决条件。神经发育异常由推断为3D基因组的机制组合调控。

DSBs发生在生理转录、DNA复制和抗原受体多样化过程中。叶酸 required 在核苷酸的 de novo 合成过程中转移一碳单位。尽管叶酸缺乏诱导的DSBs倾向于在启动子和活性增强子中积累，与内源性DSBs相似，但它们之间存在一些差异。对于内源性DSBs，转录对DSB形成没有因果效应，如逻辑模型和因果关联测试所揭示。在我们先前研究中，我们使用下一代测序评估了正常和MTX处理mESCs中DSB富集的质量和数量。我们还通过将MTX处理mESCs中的DSB富集除以正常mESCs中的DSB富集来计算全局DSB水平。测量这些DSB水平消除了mESCs中内源性DSBs的偏差，从而反映MTX处理后的基因组不稳定性。重要的是，DSB水平在基因表达和调控中具有生物学意义。DSB水平与TSSs和DSBs之间的距离负相关。调控元件的丰度与DSB比率正相关。发现DSB水平与染色质中的TADs相关，DSB比率的显著激增和整个TAD谱中基因转录的显著增强。此外，与DSB相关的SVs与NTDs患者脑中的神经基因表达相关。我们研究中定量表征的DSB水平是有意义的，并为DSBs在各种疾病中的功能提供了新见解。然而，需要额外实验来确定DSB协调的3D染色质结构如何破坏神经发育基因表达 contributes to NTD表型。此外，值得注意的是，我们的研究未包括无NTD表型的MTX处理胎儿。未检查这些未受影响胎儿，神经组织中DSBs的状态仍未确定。这一 gap 阻碍了关于观察到的DSB改变是 specifically pathogenic（即NTDs的因果）还是 merely 对叶酸破坏的 generalized responses 的明确结论，后者可能即使在没有明显畸形的情况下发生。未来研究应包括对照组以澄清DSB失调在驱动NTD发病机制中的特异性。

在本研究中，我们使用多维数据集构建了叶酸缺乏的全基因组遗传景观。我们的结果表明DSBs可以改变调控元件与基因之间的互作，并进一步影响转录活性。总之，我们的研究揭示叶酸缺乏引起一碳基团紊乱，导致受损的DNA合成和病理性的DSBs增加。因此，神经管闭合相关基因的异常表达被认为是NTDs发生的重要机制之一。我们的发现强调了理解基因、其结构复杂性以及3D染色质组织与DSBs关系的重要性。叶酸缺乏下NTDs内过度的DSB相关三维基因组组织破坏 contributes to 神经管闭合相关基因的失调。这些模型有潜力通过操纵3D染色质结构帮助治疗干预的发展。