ARIP1缺失通过SMAD3和p38 MAPK信号通路增强Activin A对脑缺血神经元铁死亡的抑制作用

本研究揭示了Activin A（Act A）通过调控SMAD3和p38 MAPK信号通路抑制脑缺血诱导的神经元铁死亡的新机制。ARIP1缺失可增强Act A的神经保护作用，上调GPX4并下调SLC7A11表达，显著改善神经功能缺损和脑梗死体积。该发现为缺血性脑卒中提供了潜在治疗靶点。

　　

1 引言

缺血性脑卒中因血管闭塞导致脑缺血、神经元死亡和神经功能缺损。尽管溶栓治疗有效，但多数患者难以获得理想疗效，且治疗可能引发继发性损伤。神经保护强调卒中后及时干预以最小化神经元死亡。铁死亡作为一种铁依赖性细胞死亡形式，由脂质过氧化积累驱动，是脑缺血损伤的重要机制。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）作为铁死亡关键调控因子，在脑缺血后活性显著降低。研究显示铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）可减轻脑缺血诱导的神经元损伤。Slc7a11基因编码胱氨酸/谷氨酸转运体xCT，是GPX4的上游调控因子，在缺血性脑卒中后的铁死亡过程中表达上调。

Activin A（Act A）作为TGF-β超家族成员，在缺血性脑卒中、神经精神疾病和神经退行性疾病中发挥神经保护作用。近期研究表明其通过抑制缺血诱导的自噬和凋亡发挥显著保护效应。Act A的细胞内信号转导主要依赖activin A/SMADs通路，并通过Act A/SMADs通路在脑缺血后发挥神经保护作用。Activin受体相互作用蛋白1（ARIP1）通过与ActRII受体和SMAD3相互作用，成为神经元中Act A信号通路的负调控因子。非SMAD依赖通路包括MAPKs、PI3K/AKT/mTOR和小G蛋白通路。越来越多的证据表明，Act A除激活Act A/SMADs信号通路外，同时抑制JNK和p38 MAPK通路，从而减少脑缺血后神经元死亡。然而，Act A和ARIP1在脑缺血损伤神经元铁死亡中的作用和机制尚不明确。

2 材料与方法

研究使用8周龄C57BL/6J小鼠和相同遗传背景的ARIP1杂合缺失（Arip1^-/+）小鼠。通过CRISPR/Cas9系统构建Arip1^-/+小鼠模型。原代神经元培养采用MEM/EBSS培养基，并在含5% O₂、5% CO₂和90% N₂的缺氧培养箱中37°C处理4小时诱导氧糖剥夺（OGD）损伤。神经元分为Control（Ctrl）、OGD、OGD-Act A、OGD-BIRB796或OGD-SRI-011381以及Act A-Anisomycin或Act A-SB-431542组。BIRB796作为p38信号通路抑制剂，SRI-011381作为SMAD信号通路激动剂，Anisomycin作为p38信号通路激动剂，SB-431542作为SMAD信号通路抑制剂。

RNA测序在Illumina NovaSeq 6000平台进行，差异表达基因筛选标准为|log₂(FoldChange)| > 1且p值 < 0.05。采用铁含量检测试剂盒测定Fe²⁺水平，MDA检测试剂盒测定脂质过氧化程度，GSH和GSSG检测试剂盒评估GSH水平。使用Western blotting分析铁死亡相关蛋白表达，免疫荧光检测ACSL4表达。通过TTC染色测定脑梗死体积，Longa评分和神经严重程度评分（NSS）评估神经功能。统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件，数据以均值±标准差表示，组间比较使用t检验或单因素方差分析。

3 结果

3.1 RNA测序鉴定OGD处理神经元的差异表达mRNA

通过神经元标志物MAP2和胶质细胞标志物GFAP的双重染色鉴定培养的存活细胞为神经元。原代培养神经元在OGD条件下呈现时间依赖性的细胞活力抑制。不同浓度Act A处理显示，Act A增强OGD处理神经元的活力，25 ng/mL和50 ng/mL Act A处理组间无显著差异，故后续实验采用25 ng/mL浓度。

RNA测序分析发现，与单独OGD处理相比，Act A处理显著下调43个基因、上调39个基因的表达。比较Ctrl与OGD组、OGD与OGD-Act A组的差异表达基因，鉴定出49个在两组比较中共同差异表达的基因。KEGG通路分析显示这些基因涉及钙信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调控、Ras信号通路和铁死亡等多条信号通路。热图分析表明Act A显著下调铁死亡核心标志物Slc7a11的表达，该基因编码胱氨酸/谷氨酸转运体xCT。qPCR分析证实Slc7a11、Pdk4、Angptl4和Creb3l2的mRNA水平与生物信息学结果一致。

3.2 Act A保护 against OGD诱导的神经元铁死亡

铁死亡抑制剂Fer-1减轻了OGD诱导的神经元死亡，Act A显著抵抗铁死亡诱导剂erastin引起的死亡，表明Act A减少OGD诱导的神经元铁死亡发生。OGD处理后神经元内Fe²⁺水平显著升高，Act A预处理逆转这一效应。MDA作为脂质过氧化终产物，其水平在OGD处理后升高，Act A处理显著降低MDA水平。GSH/GSSG检测显示OGD显著降低GSH水平，Act A预处理逆转此效应。OGD导致细胞内和线粒体ROS积累，Act A预处理显著抵消这些OGD诱导的增加。

Western blotting分析显示，与单纯OGD相比，OGD+Act A处理神经元中FPN1蛋白表达显著升高，而TF和TFR蛋白表达显著降低。免疫荧光检测发现OGD显著上调ACSL4蛋白表达，Act A预处理逆转此效应。这些结果证实Act A预处理减轻OGD诱导的神经元铁死亡。

研究表明脑缺血导致Act A/SMAD3通路抑制和p38 MAPK通路激活，两者在缺血损伤后的神经元凋亡中发挥重要作用。实验数据显示OGD处理显著增加p-SMAD3水平和p-SMAD3/SMAD3比值，增加p-p38 MAPK水平和p-p38MAPK/p38 MAPK比值，Act A预处理逆转这些OGD诱导的效应。

3.3 Arip1杂合敲除通过SLC7A11/GPX4通路减轻OGD诱导的神经元铁死亡

基于RNA测序结果，评估SLC7A11和铁死亡相关蛋白GPX4的蛋白表达。OGD处理显著下调GPX4表达、上调SLC7A11表达，Act A预处理产生相反效应。OGD条件下神经元中ARIP1蛋白表达显著增加，Act A给药显著减弱此增加。为研究ARIP1表达是否与activin A抑制神经元铁死亡有关，使用Arip1^-/+小鼠进行研究。

原代神经元培养并接受OGD处理后， bright field显微镜评估细胞形态变化。野生型（WT）神经元出现皱缩和贴壁不良，培养基中可见大量悬浮死细胞，而Arip1^-/+神经元状态较好。CCK-8检测显示Arip1^-/+组神经元存活率显著高于WT组。OGD后，Arip1^-/+神经元中Fe²⁺和MDA水平明显低于WT神经元，而GSH水平呈现相反趋势。Western blotting结果表明，OGD处理后Arip1^-/+神经元中SLC7A11蛋白表达下调而GPX4表达升高，与Act A预处理的变化一致。与WT组相比，Arip1^-/+组p-SMAD3水平显著升高而p-p38呈现相反效应。这些发现表明SMAD3和p38 MAPK通路参与Act A通过ARIP1抑制铁死亡的作用。

3.4 Act A通过调控p38/SLC7A11/GPX4和SMAD3/SLC7A11/GPX4通路抑制OGD处理神经元的铁死亡

为证实SMAD3和p38 MAPK通路在OGD诱导神经元铁死亡中的潜在机制，用特异性SMAD激动剂SRI-011381或p38抑制剂BIRB796预处理原代神经元。SRI-011381和BIRB796均显著抑制OGD诱导的SLC7A11蛋白增加，上调GPX4蛋白表达。在SMAD抑制剂SB431542或p38激活剂Anisomycin存在下，用Act A处理原代神经元，Western blotting分析SLC7A11和GPX4表达。与OGD组相比，Act A-Anisomycin和Act A-SB431542组SLC7A11蛋白表达显著降低，GPX4蛋白表达呈现相反趋势，这些结果与Act A处理无显著差异。Anisomycin或SB431542处理不改变Act A介导的上述效应。免疫荧光评估SLC7A11和GPX4蛋白表达获得相似结果。这表明Act A通过增强SMAD3和抑制p38 MAPK信号通路挽救OGD诱导的铁死亡，这两条通路位于SLC7A11/GPX4通路的上游。

3.5 pMCAO模型小鼠中检测到神经元铁死亡

为观察脑缺血损伤后是否发生铁死亡，在WT和Arip1^-/+小鼠中建立pMCAO模型模拟体内缺血损伤。与假手术组相比，pMCAO模型小鼠梗死体积显著增加。Longa和NSS评分显著高于假手术组。pMCAO组小鼠体重显著低于假手术组。H&E染色显示脑缺血导致CA1区神经元细胞丢失和核固缩。这些结果表明pMCAO模型小鼠制备成功。

通过透射电镜（TEM）检查缺血脑组织线粒体的超微结构变化。pMCAO后第3天小鼠皮层神经元分析显示，与假手术组相比，大量神经元含有肿胀线粒体，嵴数量减少。pMCAO模型小鼠Fe²⁺和MDA含量显著高于假手术组，而GSH含量显著降低。Western blotting定量铁死亡相关蛋白（GPX4、FPN1、TF和TFR）水平，发现pMCAO后GPX4和FPN1蛋白表达显著降低，而TF和TFR表达大幅增加。这些发现表明脑缺血损伤影响铁死亡相关蛋白表达，提示铁转运和氧化还原水平在pMCAO小鼠中受缺血影响。

为验证脑缺血后铁死亡下游信号通路的变化，检测相关蛋白表达。与假手术组相比，pMCAO模型小鼠脑组织中SMAD3、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白水平显著升高且随时间逐渐增加，而p-SMAD3水平呈现相反趋势。这些结果表明脑缺血期间的铁死亡可能与SMAD和MAPK信号通路有关。

3.6 Arip1杂合敲除通过调控SMAD3和MAPK通路减轻神经元铁死亡

上述体外研究发现ARIP1通过调节SMAD3和p38 MAPK信号通路，通过SLC7A11/GPX4通路抑制OGD损伤后的神经元铁死亡。接下来对Arip1^-/+小鼠实施pMCAO以验证ARIP1作为activin信号调节剂在铁死亡中的作用。pMCAO诱导的梗死体积在Arip1^-/+小鼠中显著减少。缺血后，Arip1^-/+小鼠Longa和NSS评分显著降低，体重无显著变化，CA1区存活神经元数量显著增加，H&E染色显示核固缩减少，表明Arip1^-/+小鼠缺血后呈现神经保护表型。

与WT组相比，TEM显示Arip1^-/+小鼠线粒体肿胀减少，嵴数量显著增加。pMCAO后，Arip1^-/+小鼠Fe²⁺和MDA含量显著降低，GSH水平升高，表明铁死亡在Arip1^-/+小鼠中显著减少。接下来通过Western blotting检测Act A及信号蛋白ARIP1、SMAD3和p38 MAPK的蛋白表达。随着缺血时间延长，WT组ARIP1蛋白表达上调而Arip1^-/+组无此变化。Arip1^-/+小鼠缺血组织中Act A蛋白表达显著高于WT小鼠。WT和Arip1^-/+小鼠在pMCAO后第1和第2天Act A蛋白表达均显著增加，第2天达到峰值，表明一个Arip1等位基因缺失可导致内源性Act A水平增加。脑缺血后，与WT啮齿类动物相比，Arip1^-/+小鼠p-SMAD3水平显著升高而p-p38显著降低。

为进一步验证Arip1^-/+小鼠铁死亡调控机制，检测相关蛋白表达。缺血后，Arip1^-/+小鼠GPX4蛋白表达显著高于WT小鼠。WT小鼠中，SLC7A11蛋白表达在第1和第2天显著增加，第3天下降，表明SLC7A11上调可能发生在缺血损伤诱导铁死亡的早期阶段。Arip1^-/+小鼠SLC7A11表达呈现相反趋势。这些发现表明Arip1缺失通过增加内源性Act A水平减轻脑缺血后神经元铁死亡，从而调节Act A/SMAD3和p38 MAPK信号通路，最终影响SLC7A11/GPX4通路。

4 讨论

脑缺血损伤导致神经元死亡，activin A是重要的神经保护因子。近期发现ARIP1主要表达于神经元，参与调节activin特异性信号转导。研究通过体内外方法评估Act A对脑缺血诱导铁死亡的神经保护作用，使用ARIP1杂合缺失（Arip1^-/+）小鼠。数据表明ARIP1基因缺失有助于activin A在脑缺血损伤中抑制铁死亡的神经保护作用。

神经保护代表对抗损伤分子事件链的传统方法，包括脑氧化应激、神经兴奋毒性和神经炎症，这些导致不可逆的脑缺血损伤。数十年来，研究人员一直在探索减轻神经元细胞死亡的治疗选择。神经保护措施的早期实施可减轻再灌注损伤后果，增加能从治疗中获益的患者数量，突显神经保护疗法的重要性。

Act A作为TGF-β超家族成员，参与多种生物学过程。既往工作显示Act A给药显著增加围产期大鼠缺血损伤后纹状体和海马神经元存活，挽救新生大鼠海马神经元。近期研究表明Act A对缺血性脑卒中具有神经保护作用，可通过抑制凋亡和自噬减少缺血后神经元死亡。然而，Act A在脑缺血后发挥神经保护作用的具体分子机制尚不明确。尽管缺血区域内所有细胞（包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞）都有损伤风险，神经元可能最脆弱，其死亡可能是导致脑缺血临床缺损的最重要因素。本研究发现在原代培养神经元中，Act A预处理显著抑制OGD损伤引起的神经元死亡。RNA测序分析表明Act A通过调节OGD介导的铁死亡在脑缺血后发挥保护作用。

大量证据表明铁死亡与氧化应激密切相关，ROS过量产生被认为是氧化应激的主要原因。同样，ROS过量产生是缺血环境的关键病理特征。本研究使用荧光探针在体外检测细胞内和线粒体ROS水平，发现Act A给药显著减轻OGD诱导的ROS产生增加。铁死亡的主要生化特征包括铁积累和脂质过氧化。结果确实显示Act A显著增加GSH水平，同时降低铁水平、MDA产生和ROS积累。RNA测序结果表明铁死亡相关基因Slc7a11表达显著下调。Slc7a11编码胱氨酸/谷氨酸反向转运体，将胱氨酸导入细胞，为GSH合成提供底物。然而，在葡萄糖缺乏或完全谷氨酰胺缺乏条件下，SLC7A11下调通过增强细胞内谷氨酸利用显著提高细胞活力，从而维持呼吸链活性。近期研究表明xCT介导的突触外谷氨酸释放对OGD后细胞外谷氨酸浓度升高至关重要。研究也证明在缺血性脑损伤期间，HIF-1α促进xCT上调，导致谷氨酸胞吐增加， consequently激活NMDAR，可增强神经元铁摄取，提示铁死亡的发生。正如预期，研究发现SLC7A11蛋白表达在OGD处理的原代培养神经元12小时内升高，但24小时后显著下降。Act A预处理取消4小时OGD后的诱导变化。与既往研究一致，数据显示GPX4蛋白表达在OGD处理后显著降低，Act A预处理逆转此效应。

近期研究揭示SMAD3和p38 MAPK信号均参与脑缺血损伤，但activin A与这些信号在成人脑缺血模型中的关系尚不明确。ARIP1在大脑中大量存在，具有多个蛋白-相互作用结构域，与SMAD3和ActRIIA相互作用。既往研究报道ARIP1抑制神经元细胞中Act A信号。同时，结果证实缺血后ARIP1蛋白表达在体内外均上调，导致氧化应激、铁死亡和神经功能缺损等病理后果。因此推测ARIP1参与activin A抑制铁死亡的过程。随后从Arip1^-/+小鼠提取原代神经元，发现Arip1杂合敲除通过激活SMAD3和抑制p38 MAPK信号通路抑制铁死亡并调节SLC7A11/GPX4通路，与Act A预处理观察到的现象相似。为识别Act A治疗对铁死亡作用的潜在机制，用特异性p38激活剂或SMAD抑制剂预处理原代神经元。结果显示Act A抑制p38激动剂和SMAD抑制剂诱导的铁死亡。这些发现证明Act A可逆转缺血损伤，提供显著证据表明activin A通过调节SMAD3/SLC7A11/GPX4和p38/SLC7A11/GPX4通路抑制铁死亡，这一过程由ARIP1缺失促进。

此外，多项研究表明脑损伤后Act A表达在mRNA和蛋白水平均升高。确实，结果显示pMCAO模型小鼠中Act A蛋白表达迅速上调，术后第2天达到峰值。然而，内源性增加可能不具有高度治疗性，而是作为损伤的生物标志物。实验剂量的Act A远高于缺血后内源性水平。

因此，增加内源性Act A水平或激活activin A信号可能代表脑缺血的有效治疗策略。作为体内模型，使用Arip1^-/+小鼠验证内源性Act A的神经保护作用。结果表明Arip1杂合敲除显著促进缺血损伤后Act A和SMAD3活性。而且发现Arip1^-/+缺失通过抑制铁死亡对脑缺血发挥神经保护作用，激活Act A/SMAD3并抑制p38 MAPK信号通路。这一发现与体外实验一致。然而，这两条信号通路在此过程中的机制并不完全相同，后续将深入探讨。

有趣的是，发现缺血3天后SLC7A11蛋白表达上调，可能导致细胞内胱氨酸转运增加和GSH合成增强，最终抑制铁死亡发生。提出xCT在脑缺血后Act A蛋白表达增加后参与两个主要生物学过程。最初，xCT活性降低以抑制谷氨酸信号，随时间推移，xCT活性增加以增强氧化还原信号和氧化应激保护，导致铁死亡抑制。然而，此效应的分子机制仍知之甚少。近期关于在钙调蛋白激酶II-alpha启动子下表达显性负性Act A受体IB构建的转基因小鼠工作为Act A作用提供了新见解。谷氨酸兴奋毒性是脑缺血损伤的重要组成部分；因此，Act A的神经保护作用可能源于减少谷氨酸能神经传递。然而，在具有显性负性Act A受体的动物中，Act A信号阻断导致意料之外的谷氨酸能传递减少。需要进一步研究确定ARIP1是否以及如何通过改变SLC7A11后的谷氨酸信号影响铁死亡。这将为Act A抑制铁死亡的机制提供重要见解。研究中证明ARIP1是缺血性脑损伤的有希望治疗靶点。

本研究尚未完全阐明相关机制。首先，仅评估了Act A与脑缺血中铁死亡的关系，其他细胞死亡途径可能也参与Act A的作用。研究表明其他形式的神经元细胞死亡，包括凋亡和自噬，在缺血神经元反应中发挥重要作用。其次，研究缺乏Act A给药剂量和途径的体内研究，限制了这些发现的临床适用性。未来研究应基于Act A在缺血性脑卒中中的潜在治疗前景解决这些局限性。

5 结论

总结而言，本研究调查了Act A对脑缺血诱导铁死亡的神经保护作用，并试图识别潜在机制。重要的是，研究确立Act A的神经保护特性涉及ARIP1通过调节Act A/SMAD3和p38 MAPK通路调控SLC7A11/GPX4通路。而且，验证Arip1杂合敲除改善pMCAO小鼠模型的神经功能缺损并抑制铁死亡。Arip1^-/+小鼠显示内源性Act A水平增加，随后影响SMAD3和p38 MAPK通路，导致铁死亡抑制。这些发现为脑缺血的发病机制和潜在治疗靶点识别提供了宝贵见解。