TSPAN7通过STK11/AMPK/mTOR轴抑制结直肠癌进展的机制研究

本研究发现四跨膜蛋白TSPAN7在结直肠癌（CRC）中显著低表达，通过激活STK11/AMPK信号轴并抑制mTOR通路，显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。该研究为CRC靶向治疗提供了新思路，揭示了TSPAN7作为抑癌基因的潜在临床价值。

　　

引言

结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与多种风险因素相关，包括肥胖、久坐生活方式、吸烟、人口老龄化和饮食习惯等。尽管现代医疗技术在癌症诊断和管理方面取得了显著进步，但结直肠癌的发病率和死亡率仍然较高。由于结直肠癌在早期往往无明显症状，多数患者确诊时已处于晚期，因此寻找新的治疗靶点至关重要。

四跨膜蛋白7（TSPAN7）是一种高度保守的四次跨膜糖蛋白，其结构域可与多种伴侣蛋白结合。TSPAN7介导的信号通路可能影响细胞发育、活化、生长和运动等过程。既往研究表明，TSPAN7在胃肠道癌细胞中表达，并对肝细胞癌的增殖和侵袭具有调控作用。然而，TSPAN7在结直肠癌中的具体作用尚未明确。本研究旨在探讨TSPAN7对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响，并阐明其可能的作用机制。

材料与方法

2.1 肿瘤学数据库分析

从基因表达 Omnibus（GEO）数据库中获取结直肠癌组织和正常结肠组织的转录组数据。通过R语言分析基因表达谱（GSE62646），筛选差异表达基因（DEGs）。将差异表达基因与加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果进行交集分析，结合LASSO回归模型和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）算法筛选潜在生物标志物，并在临床样本中进行验证。使用R包“clusterProfiler”对差异表达基因进行功能注释，包括基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）。

2.2 细胞培养

人结直肠癌细胞系（Caco2、SW480、HCT116和HT29）和正常人结肠细胞系（NCM460）购自美国ATCC公司。所有细胞系均在DMEM培养基（Gibco）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS），并在37°C、5% CO₂的培养箱中维持培养。

2.3 蛋白质免疫印迹

组织和细胞系经裂解缓冲液（RIPA缓冲液）在4°C条件下裂解，随后在4°C下以12,000 × g离心15分钟，去除细胞碎片。收集上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒定量总蛋白。取20 μg蛋白质通过10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转印至0.22 μm PVDF膜。膜封闭后，与一抗在4°C下孵育过夜，随后与适当的二抗在室温下孵育2小时。通过增强化学发光法显示抗体染色结果。

使用的一抗信息如下：抗TSPAN7（Abcam, ab211870）、抗mTOR（Abcam, ab134903）、抗pAMPK（Abcam, ab92701）、抗tAMPK（Abcam, ab32047）、抗STK11（Abcam, ab199970）和抗GAPDH（Abcam, ab8245）。

2.4 免疫组织化学研究

结直肠癌组织用4%多聚甲醛固定3-4小时，切成2 mm厚的切片并贴附于预涂玻片上。经过脱水、脱蜡和水化处理后，按照说明书在4°C下添加一抗孵育过夜，随后添加二抗并在显微镜下拍照。

2.5 细胞活力分析

通过CCK-8 assay测定细胞活力。简要步骤如下：将5000个细胞/孔接种于96孔平板中，分别在24、48和72小时时间点添加CCK-8 assay试剂（按培养基体积的1:10比例添加）。细胞在室温下避光孵育1小时，使用分光光度计在450 nm波长下测定吸光度。根据说明书计算细胞活力。

2.6 细胞划痕实验

将细胞接种于6孔平板中，待细胞融合度达到90%时，使用200 μL移液器吸头轻轻刮除细胞单层，形成均匀的划痕。划痕形成后，用PBS清洗三次以去除漂浮细胞，更换新鲜培养基。将细胞在CO₂培养箱中继续培养24小时，分别在初始阶段和24小时后拍摄图像，使用显微镜评估细胞向划痕区域的迁移情况。

2.7 细胞侵袭实验

实验在24孔、8 μm transwell细胞培养 chamber中进行， chamber内涂覆Matrigel。细胞使用0.25% EDTA胰蛋白酶消化后，将200 μL细胞悬液加入上室，下室中加入600 μL含10%血清的培养基。经过24小时标准培养后，用甲醇固定细胞30分钟，吉姆萨染色30分钟。使用倒置显微镜计数剩余细胞。

2.8 细胞转染

细胞转染在细胞培养板中进行，将所需数量的细胞接种于孔中，待细胞融合度达到50%时，用PBS清洗三次。通过BLOCK-iT RNAi Designer设计针对TSPAN7 mRNA不同区域的siRNAs，并通过BLAST分析确保其特异性，以最小化脱靶效应。化学合成的siRNAs购自Ambion，非靶向siRNA用作阴性对照。使用Lipofectamine 3000进行转染，按照制造商协议操作。转染48小时后，通过定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blot验证敲低效率。将siRNA和Opti-MEM（无FBS）溶液与Lipofectamine 3000混合，最终浓度为100 nM。将制备的溶液加入细胞中，孵育6小时后更换新鲜培养基，继续培养48小时后进行后续处理。

2.9 定量实时PCR

使用TRIzol试剂（Vazyme Biotechnology）提取总RNA，按照制造商说明操作。使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green Master Mix（Vazyme Biotechnology）在ABI 7900系统（Applied Biosystems）上进行qRT-PCR。每个反应重复三次，使用2?△△CT方法计算基因表达变化。本研究使用的引物序列如下：

TSPAN7：正向：5′- CTGGTTGCTGGTCTGGTCTT -3′；反向：5′- AGGCTTGTCCTTGTCCTCCT-3′。

2.10 统计分析

本研究的所有结果均以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9进行统计分析，两组比较采用Student’s t检验，多组比较采用单因素方差分析。p值 < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

3.1 生物信息学分析

通过GEO数据库对132例结直肠癌患者和54例对照个体进行转录组分析，共鉴定出145个显著差异表达的mRNAs，其中47个mRNAs上调，98个mRNAs下调。通过火山图可视化差异表达基因，这些基因用于评估结直肠癌患者的生存预后。42个mRNAs与结直肠癌患者良好或不良生存预后相关。这些mRNAs在GO功能注释中富集于分子功能、生物过程和细胞组分类别，以及KEGG通路。分析发现，这些mRNAs显著参与DNA构象变化、受体调节活性、蛋白质-DNA复合物和转录因子活性。 among these differentially expressed mRNAs, 10个mRNAs被鉴定为显著差异表达：CA1、CHP2、MMP1、CXCL8、HSD17B2、TSPAN7、MS4A12、SLC26A2、DHRS9和HSD11B2。本研究选择表达量最高的RNA，即TSPAN7，探讨其在结直肠癌中的作用。

3.2 TSPAN7在结直肠癌细胞中表达下调

通过qRT-PCR分析正常结肠和结直肠癌组织的基因表达，结果显示TSPAN7 mRNA在结直肠癌组织中显著下调。蛋白质免疫印迹进一步证实TSPAN7蛋白在结直肠癌组织中表达降低。体外实验分析结直肠癌细胞系（Caco2、SW480、HT29和HCT116）中TSPAN7的表达，结果与组织中的发现一致。与正常结肠细胞（NCM460）相比，结直肠癌细胞中TSPAN7 mRNA和蛋白表达均下调。免疫组织化学检测发现，TSPAN7在结直肠癌细胞中低表达，主要分布于细胞质中。此外，TSPAN7表达越低，患者预后越差，生存率越低。

3.3 TSPAN7过表达抑制结直肠癌细胞迁移和增殖

为了进一步探讨TSPAN7对结直肠癌细胞恶性行为的影响，通过pcDNA-TSPAN7进行体外过表达实验。RT-PCR和蛋白质免疫印迹结果显示，pcDNA-TSPAN7显著上调细胞中TSPAN7的表达。同时，检测结直肠癌细胞的增殖能力，发现过表达TSPAN7的细胞增殖能力显著降低。克隆形成实验进一步表明，TSPAN7过表达显著减少克隆的数量和大小。侵袭实验证实，TSPAN7过表达有效抑制细胞侵袭。这些发现表明，TSPAN7在抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭中发挥关键作用。

3.4 TSPAN7抑制加剧结直肠癌细胞迁移和增殖

为了探究TSPAN7下调对结直肠癌细胞恶性行为的影响，设计了三组siRNAs转染至这些细胞中。通过蛋白质免疫印迹和RT-PCR评估这些siRNAs的敲低效率，结果显示TSPAN7 si-2的敲低效率最高，显著降低结直肠癌细胞中TSPAN7的表达。TSPAN7沉默后，结直肠癌细胞的增殖能力显著增强。侵袭实验进一步证实，TSPAN7过表达降低结直肠癌细胞的恶性程度。

3.5 TSPAN7通过STK11/AMPK/mTOR轴抑制结直肠癌细胞增殖

本研究检测了TSPAN7过表达对结直肠癌细胞中AMPK/mTOR信号的影响，发现过表达TSPAN7的细胞中磷酸化AMPK（p-AMPK）水平升高，STK11蛋白上调，表明TSPAN7可能通过STK11激活AMPK信号。尽管未直接评估磷酸化mTOR（p-mTOR）水平，但总mTOR表达降低，提示mTOR通路活性可能受到抑制。肿瘤细胞的增殖与其代谢活性密切相关，STK11在这一机制中发挥关键作用。为了探究TSPAN7是否通过STK11影响肿瘤细胞增殖，用STK11抑制剂radicicol处理过表达TSPAN7的结直肠癌细胞。Radicicol处理显著降低p-AMPK表达，与STK11活性抑制一致。有趣的是，该处理逆转了TSPAN7对结直肠癌细胞增殖的抑制作用，并增强细胞侵袭和迁移能力。这些结果表明，TSPAN7可能至少部分通过STK11/AMPK通路发挥其对结直肠癌进展的抑制作用，但mTOR信号的参与仍需进一步确认。

讨论

本研究发现TSPAN7在结直肠癌细胞中表达下调，相关性分析显示TSPAN7与结直肠癌细胞的增殖和迁移呈负相关。此外，TSPAN7通过STK11/AMPK/mTOR轴影响结直肠癌细胞增殖。这些发现为结直肠癌治疗提供了新靶点。

本研究通过生物信息学和实验分析验证了TSPAN7在结直肠癌中的低表达，这是首次证实这一发现。既往多项研究报道了TSPAN7在多种疾病中的作用。TSPAN7对大脑发育的影响涉及刺激轴突分支，而在胰腺胰岛细胞中，TSPAN7控制Ca²⁺通道，进而影响胰岛素分泌。有趣的是，TSPAN7在肿瘤细胞中是一把双刃剑。在肝细胞癌中，TSPAN表达与患者预后呈正相关；而在肺癌细胞中，其表达与预后负相关。本研究假设TSPAN7在结直肠癌中表达下调，类似机制可能存在于其他胃肠道肿瘤，但需进一步验证。本研究还表明，上调TSPAN7可抑制结直肠癌细胞的生长和侵袭。在细胞膜上，TSPAN7形成TSPAN网络，参与细胞运动、形态发生以及细胞内外物质和信息的交换。肿瘤细胞活性主要源于细胞内能量代谢的变化。通过调节物质交换，TSPAN7直接影响肿瘤细胞的活性。

AMPK是调节能量稳态的关键激酶，其活化可导致mTORC1磷酸化下调，影响细胞自噬、凋亡和增殖。多项研究报道，AMPK可抑制肿瘤增殖涉及的代谢过程。本研究揭示了一个新发现：TSPAN7在STK11的调控下影响AMPK的磷酸化。该信号蛋白作为上游激酶，在细胞内AMP和ADP水平升高时触发AMPK蛋白的活化。STK11作为一个进化上保守的能量感应通路的一部分，与细胞代谢和生长相关。它也被报道为肿瘤细胞中的关键玩家，抑制生长。因此，本研究结果表明，TSPAN7可通过STK11/AMPK/mTOR轴抑制结直肠癌细胞系的增殖。

本研究存在若干局限性。首先，研究提供了强有力的体外证据，但缺乏使用动物模型的体内实验，限制了对TSPAN7在肿瘤微环境中作用的理解。其次，研究聚焦于STK11/AMPK/mTOR轴，但其他信号通路也可能 contribute to结直肠癌进展，需进一步研究。第三，尽管使用radic探究STK11/AMPK/mTOR轴，但它不是STK11的特异性抑制剂，同时靶向HSP90，可独立抑制mTOR信号。未来研究应使用更选择性的抑制剂或遗传工具验证上游调控机制。第四，本研究在单一结直肠癌细胞系模型中进行，可能限制发现的普适性。未来研究需要使用多种结直肠癌细胞系和体内模型验证TSPAN7在结直肠癌进展中的作用。

结论

本研究表明，TSPAN7在结直肠癌中表达下调，并抑制肿瘤细胞增殖和侵袭。这些效应至少部分通过STK11/AMPK信号轴介导。TSPAN7可能作为结直肠癌的新治疗靶点。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

资金支持

作者未获得特定资金支持。

支持信息

支持表1列出了与结直肠癌患者生存预后相关的42个mRNAs。