流感衍生肽NS1195-203在HLA-B44超家族分子中的免疫原性缺失现象及其对通用疫苗设计的启示

本文深入探讨了流感病毒非结构蛋白衍生肽NS1195-203在HLA-B44超型分子中的呈递特性与免疫原性差异。研究通过NetMHCpan4.1结合亲和力预测、TFold与AlphaFold2结构模拟及体外T细胞免疫应答实验，揭示了尽管超型分子共享相似肽结合基序，但其诱导CD8+ T细胞应答的能力存在显著差异。该发现挑战了基于HLA超型的疫苗设计策略，强调需综合考量免疫原性而非仅依赖结合预测，为下一代T细胞介导的通用流感疫苗开发提供关键理论依据。

　　

引言

流感病毒每年导致全球超过65万人死亡，尽管现有疫苗广泛使用，但其主要靶向表面糖蛋白血凝素（HA），该蛋白易发生抗原漂移，需要每年更新疫苗。CD8⁺ T细胞通过识别人类白细胞抗原I类（HLA-I）分子呈递的病毒衍生肽段，在抗流感免疫中发挥关键保护作用。HLA-I分子具有高度多态性，目前已有超过28,000种等位基因被描述，且全球分布不均。为克服这种多态性带来的挑战，研究者提出HLA超型概念，即具有相似肽结合基序的HLA-I分子亚群，可能呈现重叠的肽库。选择能被多种HLA-I分子呈递且具有免疫原性的肽段，有望部分解决HLA多态性问题。

HLA-B44超型包括HLA-B40:01、HLA-B40:02、HLA-B44:02、HLA-B44:03和HLA-B45:01，这些等位基因的全球累积频率约为16.9%，覆盖约13亿人口。本研究选取已知的HLA-B44:03限制性流感衍生肽NS1_195-203（序列SETLQRFAW），该肽源自流感非结构蛋白1（NS1），在1971年至2021年澳大利亚流行的A/H1N1和H3N2病毒株中高度保守，且先前研究显示其在HLA-B*44:03阳性样本中能诱导强烈的CD8⁺ T细胞应答。

方法

研究使用NetMHCpan4.1预测NS1_195-203肽与各HLA-B44超型分子的结合亲和力。通过TFold和AlphaFold2进行结构模拟，预测肽-HLA复合物三维结构。从表达特定HLA-B44超型分子的供体外周血单核细胞（PBMCs）中建立NS1_195-203特异性CD8⁺ T细胞系，并通过细胞内细胞因子染色（ICS） assay评估免疫原性，检测指标包括IFNγ、TNF、CD107a、IL2和MIP1β。

结果

NS1_195-203与HLA-B44超型分子的结合亲和力及基序偏好

NetMHCpan4.1预测显示，NS1_195-203与HLA-B44:02和HLA-B44:03具有高亲和力（<15 nM），而与HLA-B40:01、HLA-B40:02和HLA-B45:01为弱结合。所有五种HLA-B44超型等位基因均偏好P2为谷氨酸（Glu），这与NS1_195-203肽的P2-Glu一致。然而，PΩ（肽C端锚定残基）偏好存在差异：HLA-B44:02和HLA-B44:03偏好大芳香族侧链（Tyr、Trp、Phe），而NS1_195-203的PΩ为Trp；HLA-B40:01和HLA-B40:02偏好较小疏水残基（Leu），HLA-B45:01则偏好更小残基（Ala）。这种PΩ偏好差异可能导致结合亲和力不同。

NS1_195-203-HLA-B44复合物的结构预测

TFold和AlphaFold2预测的结构显示，五种HLA-B44等位基因与NS1_195-203肽复合物的整体结构相似，但P9-Trp构象存在显著差异。在HLA-B44:02、HLA-B44:03和HLA-B40:02中，P9-Trp侧链向下指向裂隙，发挥经典锚定残基作用；而在HLA-B40:01和HLA-B45:01中，P9-Trp侧链旋转90°，以避免与Leu81、Tyr126（HLA-B40:01）或Leu126、Trp159、Trp105（HLA-B45:01）发生空间冲突，非经典构象可能影响肽稳定性及T细胞识别。TFold误差评分表明，HLA-B44:02和HLA-B*44:03模型置信度更高（评分<6.8），而其他等位基因评分较高，预示结构预测准确性较低。

NS1_195-203肽的免疫原性评估

ICS assay显示，NS1_195-203肽在HLA-B44:03阳性样本中免疫原性最强（平均6.52% IFNγ⁺CD8⁺ T细胞），在HLA-B44:02阳性样本中次之（平均0.23%）。HLA-B40:01阳性样本中检测到微弱应答（平均0.057%），而HLA-B40:02和HLA-B45:01阳性样本中未观察到显著应答。多功能性分析表明，HLA-B44:03和HLA-B*44:02阳性样本中的CD8⁺ T细胞同时产生TNF、CD107a、MIP1β等多种效应因子，但IL2分泌较少。应答T细胞主要同时产生1-3种效应因子，少数产生4种，无细胞同时产生所有5种效应因子。

讨论

本研究揭示，尽管HLA超型分子可能结合相同肽段，但其诱导CD8⁺ T细胞应答的能力存在显著差异。NS1_195-203肽在HLA-B44:02和HLA-B44:03中具有免疫原性，而在其他HLA-B44超型分子中几乎无应答，这与结合亲和力预测及结构模拟结果一致。肽免疫原性受多种因素影响，包括个体感染或疫苗接种史、初始或记忆T细胞频率、蛋白表达时序与丰度、肽处理效率、肽-HLA亲和力及个体内其他HLA分子竞争等。当前HLA超型分类主要基于肽结合基序或呈递结构，未充分考虑免疫原性，这限制了其在疫苗设计中的直接应用。

尽管存在挑战，针对HLA超型仍为疫苗开发提供了一种可行策略，有望减少所需肽段数量并扩大人群覆盖率。未来需整合更多免疫原性数据及不同HLA分子结构信息，结合人工智能与机器学习方法，优化免疫原性预测，推动通用T细胞介导疫苗的发展。

方法详情

伦理与样本

研究获La Trobe大学人类伦理委员会批准（HEC21097），遵循赫尔辛基宣言。PBMCs来自志愿者或澳大利亚红十字生命血液库，通过Ficoll密度梯度离心分离，HLA分型由CareDx或VTIS完成。

T细胞系生成与ICS

NS1_195-203肽（>80%纯度）刺激PBMCs，培养10天，添加IL2。ICS使用CD107a、IFNγ、TNF、IL2、MIP1β抗体，通过流式细胞术分析。

生物信息学分析

NetMHCpan4.1预测结合亲和力，UniProt Align进行序列比对，TFold和AlphaFold2（通过ColabFold）进行结构预测。

致谢

感谢IEDB、IPD-IMGT/HLA、UniProt、PyPOP、TFold、AlphaFold2等数据库与工具提供资源，感谢澳大利亚红十字生命血液库及所有志愿者，感谢La Trobe大学生物成像平台。