2型与非2型哮喘外周天然淋巴细胞（ILC）和T细胞表型差异及其机制研究

本研究通过18参数流式细胞术分析哮喘患者外周血淋巴细胞亚群，发现CD4+ CRTH2+记忆T细胞与2型（T2）特征普遍相关，而CD62L+ ILC2s升高和CD4+ KLRG1+中央记忆T细胞降低特异性表征T2哮喘。非T2哮喘则与CD45RO+ ILC2s及CD8+记忆T细胞增加相关，揭示了不同哮喘内型的免疫细胞特征，为精准诊疗提供新视角。

　　

ABSTRACT

Background

本研究旨在阐明2型（T2）和非2型（non-T2）哮喘中T细胞和天然淋巴细胞（ILC）亚群的差异，以揭示疾病机制。通过分析血液中ILC、CD4+和CD8+ T细胞群体，区分伴有或不伴哮喘的T2和non-T2特征。

Methods

研究人群选自瑞典基于人群的BAMSE队列的86名年轻人。哮喘和非哮喘受试者根据吸入性过敏原致敏和/或血液嗜酸性粒细胞计数≥0.3×10⁹/L分为T2组，non-T2组则无吸入性过敏原致敏且嗜酸性粒细胞计数<0.3×10⁹/L。采用18参数流式细胞术分析PBMC样本，识别ILC、CD4+和CD8+ T细胞群体。对归一化后的流式数据应用层次聚类，并采用逻辑回归模型进行分析。

Results

CD4+ CRTH2+ T记忆细胞频率较高与T2特征相关，且独立于哮喘状态。CD62L+ ILC2s频率在T2哮喘中较高，而CD4+ KLRG1+中央记忆T细胞频率较低。non-T2哮喘与CD45RO+ ILC2s和CD8+记忆T细胞频率增加相关。

Conclusion

T2哮喘和non-T2哮喘具有不同的ILC和T细胞群体特征。进一步研究non-T2哮喘中的ILC和CD8+ T细胞亚群有助于深入理解其潜在疾病机制。

Abbreviations

研究中使用了多项缩写，包括BAMSE（儿童、过敏、环境、斯德哥尔摩、流行病学）、BF%（体脂百分比）、BMI（体重指数）、CCR4（C-C模体趋化因子受体4）、CRTH2（趋化因子受体同源分子）、ERS/ATS（欧洲呼吸学会/美国胸科学会）、FeNO（呼出气一氧化氮分数）、FEV1（1秒用力呼气容积）、FVC（用力肺活量）、GINA（全球哮喘防治倡议）、GLI（全球肺倡议）、IgE（免疫球蛋白E）、IL-4RA（IL-4受体）、IL-x（白细胞介素x）、ILC（天然淋巴细胞）、NK（自然杀伤细胞）、OR（比值比）、RV（代表变量）、ST2（肿瘤发生抑制蛋白2）、T2（2型）、TCM（T中央记忆细胞）、TEM（T效应记忆细胞）、Tc2（CD8+ 2型细胞毒性T细胞）、Thx（CD4+ x型T辅助细胞）。

1 Introduction

2型（T2）免疫反应在防御病原体中起作用，但失调时可引发多器官系统疾病。T2疾病共享功能机制（内型），包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎和结膜炎以及慢性鼻窦炎。哮喘可根据气道炎症过程分为T2和non-T2内型，通常使用IgE致敏、FeNO、血液或痰嗜酸性粒细胞进行分类。

T2哮喘涉及T2 T辅助（Th2）细胞和T2天然淋巴细胞（ILC2s）作为炎症中枢介质，导致嗜酸性粒细胞增多和IgE致敏。T2细胞释放的T2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-9和IL-13）响应受损气道上皮细胞的警报素释放和过敏原挑战，导致典型T2表现。ILC2s是抗原非依赖性免疫细胞，被视为Th2细胞的先天对应物，是T2细胞因子的有效生产者，从而驱动T2炎症。气道中ILC2的失调可能导致有害效应，如引发气道炎症和随后的哮喘发展，或诱发哮喘急性发作。据报道，哮喘患者外周血、痰和支气管肺泡灌洗液中ILC2s的绝对和相对数量升高，且通过产生更高水平的T2细胞因子而更活跃。

CD8+ T细胞在哮喘中的作用一直存在争议。然而，细胞毒性CD8+ T（Tc）细胞可响应典型T2信号并在哮喘中产生T2细胞因子（称为Tc2细胞）。支气管活检中CD8+ T细胞水平升高与哮喘患者肺功能随时间下降相关。CD8+ T细胞可能表现出T2特征，如表达趋化因子受体同源分子2型（CRTH2；T2细胞的细胞标记）和释放IL-4、-5和-13。

尽管Th2细胞和一定程度上ILC2s在T2哮喘中作用明确，但Tc2细胞的作用尚不清楚。此外，其他T和ILC亚群在non-T2哮喘中的参与尚未广泛研究。通过纳入无哮喘对照组中具有和不具有T2特征的受试者，我们有机会解析与哮喘特异性T2特征相关的细胞特性。因此，我们旨在识别血液中区分伴有和不伴哮喘的T2和non-T2特征的差异ILC、CD4+和CD8+ T细胞群体，以阐明机制并最终改善常见哮喘内型的诊断和治疗。

2 Methods

2.1 Study Population

研究人群包括86名年轻人，来自正在进行的基于人群的瑞典BAMSE出生队列。受试者选自BAMSE COVID-19随访第二阶段，并根据支持信息S1：图S1进行分类。本研究使用了BAMSE 24年随访（2016-2019）的问卷数据以及BAMSE COVID-19随访的前两个阶段（BAMSE 26年随访，2020-2021）的数据。临床检查数据来自24年随访或COVID-19随访第二阶段。所有受试者均获得书面知情同意，并获得斯德哥尔摩区域伦理审查委员会的伦理许可（编号：2020-02922和2024-06052-02）。

2.2 Definitions of Subgroups

哮喘受试者（n=40）根据BAMSE COVID-19随访第一阶段或第二阶段收集的问卷中自我报告的医生诊断哮喘史，并伴有呼吸困难和/或过去12个月内使用哮喘药物。T2哮喘定义为哮喘结合吸入性过敏原IgE致敏（血清吸入性过敏原特异性IgE值≥0.35 kU/L）和/或血液嗜酸性粒细胞计数≥0.3×10⁹/L（嗜酸性粒细胞 cutoff 由欧洲呼吸学会建议）。non-T2哮喘定义为无吸入性过敏原IgE致敏且血液嗜酸性粒细胞计数<0.3×10⁹/L的哮喘。对无哮喘受试者（n=46）使用相同定义，称为具有或不具有T2特征的对照组，即T2和非T2对照组。

2.3 Variable Description

在24年随访期间，通过问卷收集特应性湿疹和鼻炎信息，并在临床检查期间测量血清特异性IgE水平。使用ImmunoCAP系统分析食物和吸入性过敏原特异性IgE致敏。在BAMSE COVID-19随访第二阶段，通过问卷收集当前吸烟和哮喘严重程度代理指标数据，如活动限制、夜间觉醒和因呼吸困难使用口服类固醇。在第二阶段临床检查中，使用生物电阻抗机器（Tanita MC 780身体成分监测仪）测量BMI和体脂百分比（BF%），并根据ERS/ATS标准使用Jaeger肺量测定装置和SentrySuite 2.17评估肺功能测量值，即1秒用力呼气容积、用力肺活量及其比值（FEV1、FVC和FEV1/FVC）。测量值基于全球肺倡议（GLI）的参考转换为z分数。最后，通过常规流式细胞术在卡罗林斯卡大学实验室测定血细胞计数。

2.4 Flow Cytometry

使用18参数流式细胞术分析在COVID-19随访第二阶段临床检查中获取的外周血单个核细胞（PBMC）样本中的ILC、CD4+和CD8+ T细胞亚群。从静脉穿刺采集的血液收集在肝素钠管中。通过FICOLL密度离心使用SepMate管分离PBMCs，稀释在90% FBS + 10% DMSO中，并储存在-150°C。在37°C下解冻PBMCs并用预温培养基洗涤。使用死细胞标记物（DCM）和表面抗体混合物在4°C下染色细胞30分钟。在通过LSRFortessa获取之前，用2%多聚甲醛固定细胞，并使用Flowjo版本10.8.1分析数据。

2.5 Statistical Methods

所有统计分析使用R版本4.3.3进行。使用tableone R包进行组间统计检验临床特征。所有离散变量通过Fisher精确检验分析，非正态分布的连续变量通过Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（四组）分析。正态分布的连续变量通过t检验（两组）或ANOVA（四组）分析。

在探索性分析中，流式细胞术数据按细胞类型分为ILC/NK细胞（166个亚群）、CD4 T细胞（122个亚群）和CD8 T细胞（122个亚群）。流式数据进行逆正态变换以确保正态性和不同参数间的尺度相似。其次，通过层次聚类选择每种细胞类型中最相关的亚群，采用“Ward.D2”方法在欧几里得距离矩阵上生成树状图并进行降维。生成的树状图在高度20处切割，通过视觉检查确定。层次聚类产生16个ILC/NK细胞簇、16个CD4 T细胞簇和12个CD8 T细胞簇，随后使用簇平均值作为每个簇的代表变量（RV）。

为识别区分伴有和不伴哮喘的T2和non-T2特征的淋巴细胞亚群，我们对每种细胞类型分别采用逻辑回归模型，调整性别、BMI（瘦或超重/肥胖根据世界卫生组织定义）、吸烟（自我报告；是/否）和血液淋巴细胞计数（×10⁹/L）。首先，我们旨在识别与T2哮喘相比non-T2哮喘相关的淋巴细胞（比较集1）。其次，我们旨在识别非哮喘者中与T2特征相关的淋巴细胞（T2对照 vs non-T2对照；比较集2）。第三，我们旨在识别哮喘中T2特征特异性但对照组中不存在的淋巴细胞（T2哮喘 vs T2对照；比较集3）。最后，我们旨在识别与non-T2哮喘相关的淋巴细胞（non-T2哮喘 vs non-T2对照；比较集4）。p值小于0.05视为显著。

3 Results

3.1 Allergic Comorbidities Differ Between T2 and Non-T2 Groups With and Without Asthma

在40名哮喘受试者中，30名（75%）为T2哮喘，10名（25%）为non-T2哮喘。在46名无哮喘受试者中，20名（43%）定义为T2对照组，26名（57%）为non-T2对照组。T2组中最普遍的T2特征是对吸入性过敏原的致敏。

比较所有四组，我们观察到T2哮喘组中湿疹、鼻炎和食物过敏原IgE致敏的患病率最高，而T2对照组的鼻炎患病率显著高于non-T2对照组。与非T2哮喘受试者相比，T2哮喘受试者的FEV1 z分数较低，尽管其他哮喘严重程度代理指标（如吸入或口服类固醇使用）在哮喘组间无差异。non-T2哮喘组中儿童期持续性哮喘（1、2或4岁以及8、12或16岁时哮喘）的患病率最高，而T2哮喘组随时间推移的鼻炎和吸入性过敏原IgE致敏患病率最高，其次是T2对照组。尽管一些对照受试者有儿童期哮喘史，但由于过去一年没有呼吸道症状和药物使用，他们在入组时被分类为对照组。

3.2 CD62L+ ILC2s and KLRG1+ Memory T Cells Associate Uniquely With T2 Asthma, While Increased CRTH2+ Memory T Cells Associate With T2 Features

首先，我们旨在识别伴有和不伴哮喘受试者中与T2特征相关的淋巴细胞（T2哮喘与non-T2哮喘比较，以及T2对照与non-T2对照比较；比较集1和2）。从这些回归模型中，CD4簇16和ILC/NK簇5的代表变量（RV）与T2哮喘显著正相关，而CD4簇9 RV与T2哮喘负相关。类似地，CD4簇16和ILC/NK簇3的RV与T2对照组显著正相关。其中，只有CD4簇16与哮喘和对照组中的T2特征均相关。

然后我们检查了这些簇中的个体亚群；在CD4簇16中，我们发现在伴有和不伴哮喘的T2组中，T效应记忆（TEM）和T中央记忆（TCM）细胞中CD4+ CRTH2+细胞的频率显著较高。在ILC/NK簇5中，我们注意到T2哮喘中ILC2s中CD62L+细胞的频率高于non-T2哮喘。相反，在CD4簇9中，我们观察到T2哮喘中TCM细胞中CD4+ KLRG1+细胞的频率低于non-T2哮喘。最后，我们检查了ILC/NK簇3中的个体亚群，并检测到T2对照组中ILCs中CD117- CD62L+细胞的频率高于non-T2对照组。总之，CD4+ CRTH2+ TEM和TCM Th2细胞频率较高与T2特征相关，且独立于哮喘状态，代表了一个常见的T2特征相关信号。然而，ILC2s中CD62L+细胞频率较高和TCM细胞中CD4+ KLRG1+细胞频率较低仅见于伴有哮喘的T2受试者。

此外，我们旨在通过比较T2哮喘与T2对照（比较集3）来识别哮喘中T2特征特异性但对照组中不存在的淋巴细胞，CD8簇6的RV与T2哮喘负相关。探索该簇中的个体亚群，我们未观察到组间显著差异。

3.3 Increased CD8+ CD45RO+ Memory T Cells and CD45RO+ ILC2s Characterize Non-T2 Asthma

然后，我们试图识别特异性与non-T2哮喘相关的淋巴细胞（non-T2哮喘与non-T2对照比较；比较集4）。从该回归模型中，CD8簇2、ILC/NK簇7和CD4簇14的RV与non-T2哮喘正相关。

我们探索了CD8簇2和ILC/NK簇7中的个体亚群，并观察到non-T2哮喘中TCM和TEM细胞中CD8+ CD45RO+细胞以及ILC2s中CD45RO+细胞的频率高于non-T2对照。对于CD4簇14，我们未观察到个体亚群的显著差异。总之，TCM和TEM细胞中CD8+ CD45RO+细胞和ILC2s中CD45RO+细胞频率较高是non-T2哮喘独有的特征。

4 Discussion

本研究旨在识别伴有和不伴哮喘受试者中与T2特征相关的淋巴细胞，并识别瑞典年轻成年人中特异性与non-T2哮喘相关的淋巴细胞。我们报告了T2哮喘中CD62L+ ILC2s频率较高和TCM细胞中CD4+ KLRG1+细胞频率较低。此外，我们观察到CD4+ CRTH2+记忆T细胞频率增加与T2特征相关，且独立于哮喘状态，代表了一个常见的T2特征相关信号。重要的是，我们的研究特别强调了non-T2哮喘内型个体中ILCs表型的变化：ILC2s中CD45RO+细胞和CD8+记忆T细胞频率较高将non-T2哮喘与non-T2对照区分开。这些亚群在哮喘背景下尚未广泛研究，尤其是在表现为non-T2内型的个体中，值得进一步研究，因为non-T2哮喘背后的机制知之甚少。

缺乏对non-T2哮喘进行深度免疫表型分析的研究。有趣的是，我们发现了non-T2哮喘中独特的细胞关联，包括与non-T2对照相比，ILC2s中CD45RO+细胞和CD8+记忆T细胞更高。CD45是T细胞和ILCs上发现的受体酪氨酸磷酸酶。初始ILC和T细胞表达CD45RA，但在受到外在刺激挑战和随后激活后，细胞转换为CD45RO表达，作为记忆状态的标记。据我们所知，non-T2哮喘中ILC2s中CD45RO+细胞频率较高的关联尚未见报道。non-T2哮喘组中CD45RO+ ILC2频率增加相对于non-T2对照组可能代表了一个更“有经验”的记忆样ILC2细胞池，但需要其他队列的进一步研究来证实这一观察结果。既往研究观察到CD45RO+ ILC2s和CD8+ T记忆细胞与类固醇耐药相关。这些细胞在non-T2哮喘中的富集表明它们可能有助于通常对皮质类固醇反应不佳的患者出现持续症状。总之，这些发现表明CD45RO+ ILC2s和CD8+ T细胞可作为类固醇无反应疾病的生物标志物，并可能帮助识别从替代治疗策略中受益的患者。这在未来旨在改善non-T2哮喘护理的纵向和分层研究中值得考虑。

non-T2内型难以捕捉，因为其定义依赖于T2特征的缺失，且研究远少于T2哮喘内型。我们对T2特征的定义基于血清吸入性过敏原特异性IgE水平和血液嗜酸性粒细胞计数，这与当前文献一致。全球哮喘防治倡议（GINA）指南对T2炎症的定义基于痰或血液嗜酸性粒细胞增加（血液中cutoff低于本研究所用）、FeNO升高、口服皮质类固醇使用和/或临床过敏驱动特征。我们的定义基于BAMSE COVID-19随访的可用数据，该数据未包括FeNO——然而，将BAMSE 24年随访时测量的FeNO加入亚组定义并未显著改变组别构成，且内型分型在1-5年内相对稳定。此外，哮喘组中很少或没有受试者使用口服皮质类固醇。我们承认，在我们的研究中，IgE致敏的存在而非血液嗜酸性粒细胞升高主要是区分T2和non-T2哮喘受试者的因素，且哮喘和特应性的共存不一定等同于T2哮喘。如已确立，我们通过缺乏T2相关特征来定义non-T2组。一项年龄与BAMSE相似受试者的研究得出结论，血清中低/无可测量过敏原特异性IgE水平足以识别non-T2哮喘。

通常与T2炎症相关的细胞群体，即ILC2s和CD4+ Th2细胞，被发现可区分T2哮喘和non-T2哮喘，支持了这些细胞有助于该内型的既往证据。增加的CRTH2+ CD4+ T细胞（也称为Th2细胞）与我们研究中哮喘和对照受试者的T2特征相关，既往与哮喘严重程度相关。T2特征并非哮喘独有，也可在具有由T2炎症驱动的共存条件的无哮喘受试者中检测到。与既往文献一致，我们还报告了通常以T2机制为特征的合并症——IgE致敏、湿疹和鼻炎——在具有T2特征的哮喘和对照组中患病率增加。这使得能够识别哮喘中T2特征特异性但对照组中不存在的淋巴细胞，反映了T2特征和T2合并症在现实世界中的重叠。此外，具有T2特征的组别外周血白细胞计数较高，有吸引力假设T2疾病是一种系统性疾病，而non-T2内型未在系统上很好捕捉（至少未在血液中）。non-T2哮喘通常与皮质类固醇耐药和更严重表型相关，尽管严重哮喘中的T2高特征与重塑和明显气道阻塞相关。我们未观察到，除了non-T2哮喘组中FEV1 z分数较低外，哮喘组间哮喘严重程度或药物使用的任何差异，尽管我们的发现可能受样本量小、年龄跨度有限和纳入轻度-中度哮喘受试者的限制。

我们认识到我们的研究有一些局限性。首先，流式细胞术分析在PBMCs上进行，未收集气道免疫细胞。目标组织的选择考虑了临床可行性和最小侵入性，但这限制了对气道环境的理解。其次，我们的流式细胞术检测专注于主要由T2亚群表达的选定表面标记，从而限制了评估调节性、1型和3型淋巴细胞群体变化以及可能增强细胞群体和亚群定义的细胞内标记和细胞因子的能力。第三，由于样本量小，尤其是在non-T2哮喘中，我们可能错过了一些相关细胞亚群。最后，我们的T2特征定义基于2年前测量的IgE水平，而嗜酸性粒细胞、ILCs和T细胞在此时在外周血中测量。在年轻人中，IgE水平在2年内预计变化不大。此外，血液嗜酸性粒细胞在单时间点测量，这是一个限制，因为嗜酸性粒细胞已知随时间波动；然而，我们额外评估了研究人群中BAMSE 24年随访和COVID-19随访之间的血液嗜酸性粒细胞稳定性，并观察到两次随访之间相对稳定的嗜酸性粒细胞水平。另外，FeNO未包括在我们的定义中，因为该数据不可用于BAMSE COVID-19随访。

这项研究有几个优势。研究设计包括来自基于人群的BAMSE队列的特征明确受试者，包括众多哮喘特征以及临床检查中的肺功能、BMI和BF%测量。此外，采用数据驱动方法进行降维和选择最相关亚群。最后一个优势是将非哮喘对照受试者分配到T2和non-T2组，使我们能够捕捉无哮喘受试者的T2合并症，并精确定位所研究哮喘内型特异性的亚群。

5 Conclusions

在年轻成年人研究中，T2和non-T2哮喘分别以不同的免疫谱为特征。non-T2哮喘与CD45RO+ ILC2和CD8+记忆T细胞特征相关，而伴有和不伴并发哮喘的T2特征则很好地由ILC2和Th2细胞特征代表。我们建议进一步研究ILC和CD8+ T细胞亚群可提供对non-T2哮喘的更深理解。

Author Contributions

Maura M. Kere: 概念化, 数据管理, 方法论, 形式分析, 资源, 初稿撰写。Sophia Bj?rkander: 概念化, 数据管理, 方法论, 项目管理, 资源, 监督, 审阅编辑。Simon Kebede Merid: 方法论, 形式分析, 审阅编辑。Natalia Hernandez-Pacheco: 方法论, 形式分析, 审阅编辑。Paul Maier: 数据管理, 调查, 资源, 审阅编辑。Anne-Sophie Merritt: 审阅编辑, 资源。Anna Bergstr?m: 资源, 审阅编辑。Inger Kull: 资源, 审阅编辑。Carsten O. Daub: 方法论, 形式分析, 监督, 审阅编辑。Jenny Mj?sberg: 概念化, 资金获取, 方法论, 项目管理, 资源, 监督, 审阅编辑。Christopher Andrew Tibbitt: 概念化, 资金获取, 数据管理, 调查, 方法论, 形式分析, 项目管理, 资源, 监督, 审阅编辑。Erik Mellén: 概念化, 资金获取, 方法论, 项目管理, 资源, 监督, 审阅编辑。

Acknowledgments

我们感谢参与BAMSE队列的受试者和父母以及多年来参与研究的所有工作人员。

Ethics Statement

所有受试者均获得书面知情同意，并获得斯德哥尔摩区域伦理审查委员会的伦理许可（编号：2020-02922和2024-06052-02）。

Consent

作者无内容报告。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。