综述：TUBA4A：一种非常规微管蛋白的故事

本综述系统总结了非常规α-微管蛋白TUBA4A的分子特性与生理功能。文章聚焦其独特的C末端尾、翻译后修饰（PTM）谱及微管动力学特征，深入探讨了其在神经元功能、血小板形成中的关键作用，及其突变导致的神经退行性疾病（如ALS、FTD）、肌病、巨血小板减少症和不孕症等疾病的分子机制，为理解“微管蛋白代码”和疾病靶点提供了新视角。

　　

1 微管蛋白代码与TUBA4A

微管不仅仅是细胞内的被动结构元件，它们是动态且响应迅速的长丝，能够精确感知细胞内部状态和环境信号。其行为受到复杂调控网络的精密控制，该网络由多样的微管蛋白同种型、广泛的翻译后修饰（PTM）以及大量的微管相关蛋白（MAPs）组成。在这一调控体系中，科学家提出了“微管蛋白代码”的概念，这是一种由微管蛋白同种型及其PTMs组合编码的分子语言。与染色质生物学中的组蛋白代码类似，这种代码提供了情境依赖的信号，塑造了微管的行为。它有助于解释结构相似的微管如何表现出显著不同的动态特性、相互作用伙伴和生物学功能。

在这一多样性中，一个α-微管蛋白同种型——TUBA4A（简称α4A）开始脱颖而出。其在多种组织（包括神经系统）中富集表达，并且日益被证实与神经退行性疾病相关联。α4A因其细微的序列差异及其深远的功能后果而备受关注。尽管α4A与其他α-微管蛋白具有高度的序列同一性，但其独特的C末端序列（无酪氨酸尾）、独特的PTM谱以及改变的微管动力学使其在生化特性上与众不同。这些生化差异奠定了其在多种细胞过程（如细胞分裂和形态发生）中的多方面作用。此外，TUBA4A基因的突变已被证实与多种临床疾病相关，包括神经退行性疾病、巨血小板减少症、肌病和女性不孕症。

2 TUBA4A中独特的氨基酸残基

微管蛋白的结构核心域（共有序列第1至441位残基）构成了微管的基本构建模块。在该区域内，与共有序列相比，TUBA4A（α4A）在14个位点具有独特的氨基酸。仔细检查发现，其中一些位点恰好位于微管组装的关键界面，即使电荷或形状的微小变化也可能影响整个纤维丝，例如T82P、L117P和A126S（残基编号始终遵循α1A）。与这些序列差异一致，近期研究表明，GMPCPP稳定的α4A/β3（天然倾向于去酪氨酸化状态）和α4A^Y/β3（合成）微管表现出比去酪氨酸化的α1B/β3或α1B/β3微管更低的自发解聚速率。这一稳定性的一个线索可能在于其核心域中两个脯氨酸残基（T82P和L117P）的替换，这被认为可以加强原丝间的横向键，从而增强微管的稳定性。另一项研究也证明，α4A/β2A微管表现出比α1A/β2A微管更低的灾难频率，这是稳定性增加的标志。这些观察结果共同表明，α4A的核心结构可能在微管晶格内起到稳定作用。

微管蛋白的C末端尾（共有序列第442至458位残基，也称为E-hook）是微管相关蛋白（MAP）相互作用和微管动力学的关键。在α4A中，C末端尾（α4A残基435至448）具有独特的序列。首先，它缺乏末端酪氨酸或苯丙氨酸，而是以谷氨酸残基结尾，使其天然处于非酪氨酸化状态。这一特性导致了α4A独特的PTM谱。在大鼠脑提取物中，酪氨酸修饰的α4A并不常见，Δ2形式则更为罕见。这与发现 tubulin tyrosine ligase (TTL) 修饰α4A的效率仅为去酪氨酸化α1B的一半左右的结果一致。TTL通常识别α1A中的Glu441和Glu449，但在α4A中，Glu441和Glu447被重新定位，且C末端尾短了两个残基。因此，当尾部与TTL的催化口袋结合时，其采取更延伸的构象，降低了酪氨酸连接的效率。其次，α4A还具有Tyr440替换，并在C末端尾中用多个天冬氨酸残基替换了甘氨酸和谷氨酸残基， subtly 重塑了局部疏水性和电荷景观。这种改变的序列可能使Glu443和Glu445暴露为多聚谷氨酰化位点，这与在大鼠脑中检测到的α4A比α1A或α1B具有更高水平的谷氨酰化相一致。考虑到这些PTMs可以进一步调节微管的特性及其与MAPs的相互作用，这些因素共同构成了α4A影响细胞中微管网络的潜在机制的显著复杂性和可塑性。

例如，α4A的C末端尾与核心域协同作用以稳定微管。研究表明，α4A C末端尾末端酪氨酸的存在与否对微管解聚速率影响很小。然而，去酪氨酸化的微管对MCAK诱导的解聚不那么敏感，表明非酪氨酸化的尾部对解聚酶活性具有保护作用。因此，α4A通过双重机制稳定微管：其核心降低内在解聚速率，而其非酪氨酸化的C末端尾降低了对解聚酶活性的敏感性。序列变异再次被证明不仅仅是微小的结构变化，而是一种功能指令：一种指导α4A如何在细胞内相互作用、组装和持续存在的代码。

3 TUBA4A的表达与细胞功能

为α4A确定的第一个具体功能涉及血小板微管的组织。对人血小板纯化的微管蛋白进行的质谱分析显示，α4A约占α-微管蛋白总量的30%。在静息或盘状血小板中，具有混合极性的微管在质膜下方形成一个环形束，称为边缘带（MB），这是一种维持血小板盘状形态的细胞骨架结构。携带Tuba4a V260E错义突变的小鼠表现出巨核细胞成熟受损和前血小板形成缺陷，导致MB中微管数量减少和巨血小板减少症。值得注意的是，来自小鼠的Tuba4a^V260E/V260E血小板缺乏可检测到的α4A表达，并显示出微管蛋白酪氨酸化增加和去酪氨酸化减少，这与α4A本质上不易被酪氨酸化的特性一致。这些发现突显了α4A在血小板发育中的重要作用，特别是在促进微管弯曲以确保MB形成和进而保证正常血小板大小方面。

α4A也在其他组织中表达。人类蛋白质图谱（HPA）数据库表明，α4A在多种人体组织中表达，并且在骨骼肌和心肌组织中表达最为显著。对心肌的研究证据表明，微管的去酪氨酸化增强了肌肉收缩过程中对机械压缩的机械抵抗力，为肌肉僵硬和收缩性提供了一种调控机制。由于α4A是天然非酪氨酸化的，其表达可能与心肌中微管去酪氨酸化存在机制上的联系，尽管需要进一步的研究来确定是否存在因果关系。此外，近期关于TUBA4A相关原发性肌病的研究表明，α4A可能在骨骼肌功能中也扮演着重要角色。

鉴于我们对中枢神经系统（CNS）的主要兴趣，我们重点介绍了HPA中单核RNA测序数据集的发现，该数据集显示α4A在整个CNS区域广泛表达，包括大脑皮层、海马体、丘脑和下丘脑。在细胞水平上，α4A在神经元中的表达高于非神经元细胞类型，如星形胶质细胞和少突胶质细胞。在小鼠中，对大脑和海马体的转录组分析显示，α4A的表达在出生后增加，并在成年期稳定在相对较高的水平。在蛋白质水平上，来自成年大鼠大脑的质谱数据显示，α4A约占α-微管蛋白总池的15%，这与其在CNS中的重要且丰富的表达一致。目前对α4A独特神经功能的理解主要来源于α4A突变体与特定临床疾病之间的关联，而直接的实验证据仍然有限。值得注意的是，α4A的C末端尾缺乏末端酪氨酸，这一特征表明其在细胞酪氨酸化-去酪氨酸化循环中具有独特的调节作用。在神经元中，TTL或tubulin carboxypeptidase (TCP)的破坏会显著损害微管动力学并改变与MAPs的相互作用，最终导致大脑发育缺陷。生化研究进一步证明，α4A可以调节TTL活性，支持了其通过这一途径有助于调节神经元结构和功能的假设。未来的研究可能需要侧重于阐明α4A在神经元中的精确作用和机制，例如，它是否表现出区室特异性定位（例如，轴突、树突、生长锥或 spines），或者是否通过除影响微管蛋白酪氨酸化之外的额外机制发挥作用，例如通过独特的动力学或不同水平的多聚谷氨酰化。

4 TUBA4A突变在神经退行性变中的作用

微管蛋白基因（包括TUBA4A）的突变与一系列神经发育和神经退行性疾病有关，这些疾病统称为微管蛋白病。这些情况强调了微管及其相关过程在神经系统发育和维持中不可或缺的作用。

在不同人群队列和个体患者中进行的大量测序研究揭示了与神经退行性疾病相关的一系列TUBA4A突变。迄今为止，研究人员已鉴定出至少21个错义突变、4个无义突变和1个剪接供体位点突变与肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）、共济失调和帕金森病有关。通过对外显子组罕见变异分析，TUBA4A首次被定义为ALS相关基因。该研究随后在家族性ALS（fALS）和散发性ALS（sALS）患者中鉴定出TUBA4A的一个无义突变和七个错义突变，其中包括两名合并FTD的患者。鉴于ALS和FTD之间已确立的临床、遗传和病理学重叠，这些发现逻辑上延伸至对FTD相关突变的研究。进一步扩大TUBA4A相关神经退行性疾病的范围，研究发现其关联超出了ALS-FTD谱系，包括共济失调和帕金森病。值得注意的是，研究人员在12名主要表现为痉挛性小脑共济失调（一种神经退行性表型）的患者中鉴定出九个错义变异。跨不同神经退行性疾病的重叠突变的存在揭示了α4A在神经退行性变中的广泛作用，暗示了共享的致病机制，同时也提出了为何表型如此多样的问题。

α4A的变化确实是这些疾病的致病原因吗？这里的核心问题在于能否建立因果关系。一些病例报告指出，α4A表达减少与ALS和带有TDP-43免疫反应性病理的额颞叶变性（FTLD-TDP）有关。支持这一点的是，使用反义吗啉寡核苷酸（AMOs）敲低斑马鱼中的tuba8l2（人类TUBA4A的直系同源基因）会导致脊髓运动神经元轴突长度显著减少和运动行为受损。值得注意的是，通过共同注射人类TUBA4A mRNA和tuba8l2 AMOs可以挽救这些表型。此外，一项关于ALS患者 microRNA 的研究发现，microRNA-1825（一种调节基因表达的小型非编码RNA）水平降低会上调微管蛋白折叠辅助因子b（TBCB），导致在细胞系和ALS患者皮层中α4A水平降低。在斑马鱼胚胎中过表达人类TBCB会降低Tuba8l2水平，并导致运动神经元缺陷。这些发现提供了关键的实验证据，表明α4A缺乏可以作为脊椎动物模型中ALS样神经病理的致病因素。然而，α4A下调的调控机制仍然知之甚少。阐明这种下调如何导致特定的神经退行性过程或加剧临床症状，将需要在临床队列或脊椎动物模型（如斑马鱼或小鼠）中进行进一步研究。

另一个关键问题是由TUBA4A突变引起神经退行性变的分子基础。发病机制可能源于由于α4A突变体构象变化、PTMs改变或α4A蛋白水平降低而导致的微管动力学和稳定性改变，这些变化影响了去酪氨酸化和酪氨酸化微管之间的平衡。这些破坏可能会损害微管与MAPs或马达蛋白之间的相互作用，导致轴突运输缺陷或更广泛的MAP功能障碍。对α4A/β4A二聚体的计算机模拟预测，像K430N（fALS）和R215C（伴有FTD的fALS）这样的突变会破坏N位点的GTP结合，而其他突变可能会增加聚集倾向。需要进一步的体外试验来评估这些突变如何影响微管动力学，而基于细胞的研究对于将生化或生物物理变化与体内病理联系起来至关重要。此外，无义突变可能会产生截短的α4A亚型，这些亚型无法融入微管，反而形成细胞质聚集体，这可能才是真正的致病驱动因素。例如，无义突变W407*会产生截短的α4A，在转染的细胞中形成泛素化包涵体。有趣的是，α4A的额外多聚谷氨酰化有助于Tau病理。然而，需要在患者来源的细胞或组织中进行确认，以确定此类聚集体是否在体内发生并具有致病性。

TUBA4A突变也在其他类型的临床病症中被识别出来。例如，它们与肌病队列相关，无论是否有明显的CNS受累，这表明α4A突变体可能通过受损的肌细胞功能放大以运动系统功能障碍为特征的神经退行性表型。此外，近期的临床研究已经确定了特定的TUBA4A突变与女性不孕症以及巨血小板减少症之间的关联。这种多效性效应进一步强调了α4A在多种组织类型中的关键功能，尽管特定突变与疾病表型之间的因果关系及其潜在分子机制仍然难以捉摸。

5 展望与前景

尽管不断有新的见解出现，但我们对α4A的理解仍然不完整，有几个基本的知识缺口需要关注。首先，α4A如何调节微管网络仍然定义不清。具体来说，尚不清楚α4A富集的微管是否以及如何差异性地招募马达蛋白（例如，驱动蛋白和动力蛋白）和其他MAPs，特别是在马达 processivity 和结合亲和力方面。需要严格的定量分析来评估这些生物物理参数。使用纯化组分进行体外重建，这是一种必要但目前仍具有挑战性的方法，可以提供关键的机制性见解。除了其生化特性之外，α4A独特的初级序列如何控制其优先融入神经元微管，或者它是否在神经元区室（例如，轴突、树突、突触）中建立空间梯度以实现局部功能，仍然未知。在Neuro-2a细胞中进行的一项比较相互作用组研究表明，α4A可能与特定的结合伙伴相关联，这激励了对其情境依赖性功能的进一步探索。

在病理水平上，α4A功能障碍与神经退行性变之间的因果关系仍有待充分阐明。悬而未决的问题包括疾病相关突变是否通过以下方式导致发病机制：（i）功能丧失机制，即可溶性α4A水平降低破坏了酪氨酸化和去酪氨酸化微管之间的平衡；（ii）通过截短突变体（如W407*）的聚集产生毒性功能获得；或（iii）显性负效应，损害微管动力学或MAP相互作用。

在方法学上，对α4A的生理功能或疾病相关突变体的研究需要合适的哺乳动物模型。动物模型（例如小鼠）中TUBA4A的条件性敲除策略可能是必要的，以避免完全删除TUBA4A可能引起的不孕症，同时维持生理性的α-微管蛋白水平以避免总α-微管蛋白表达减少带来的混杂效应将是最佳的。此外，尽管在家族性ALS或FTD患者中发现了十几种错义变异，但进一步的家族分离分析对于支持因果关系至关重要。至于α4A的生化特性，重大挑战依然存在。在没有亲和标签的情况下纯化单一的α-微管蛋白同种型在技术上仍然要求很高，阻碍了重建同种型特异性微管以与经典α-微管蛋白进行直接比较的能力。此外，带标签的微管蛋白构建体可能会改变蛋白质折叠、二聚化动力学或聚合行为，引入潜在的人工假象。类似的问题也存在于疾病研究中，在细胞系中过表达带标签的α4A突变体可能会混淆功能解释。因此，未来的研究必须严格验证源自带标签构建体的发现，以尽量减少方法学上的人工假象并确保生理相关性。