综述：庆祝膜片钳技术实现单通道记录50周年

这篇综述生动回顾了膜片钳（Patch Clamp）技术诞生50年来的科学历程。文章系统梳理了Erwin Neher和Bert Sakmann开创性建立单通道记录方法的历史背景、关键技术突破（如吉欧封接gigaseal的形成）及其对离子通道（Ion Channels）研究的革命性推动。作者通过典型案例（如乙酰胆碱受体AChR动力学研究和氯离子通道Cl-渗透机制解析）展示了该技术在揭示通道门控（Gating）、电导（Conductance）与动力学（Kinetics）方面的独特优势，并展望了其与现代光学技术和自动化平台（APC）结合的新方向。

　　

介绍

在细胞生理学和膜生物物理学领域，记录流经单个离子通道的电流曾是最令人向往且回报丰厚的研究目标之一。回顾科学史，离子通道的概念并非自古有之。直到1952年，Hodgkin和Huxley在研究乌贼巨轴突动作电位的离子基础时，尽管详细描述了Na⁺和K⁺电流的特性，却从未提及“离子通道”一词。当时，载体的概念比通道更受欢迎。

情况在接下来的几十年里逐渐改变。1960年代，Bertil Hille和Clay Armstrong通过生物物理学研究证实了早期的药理学观察，即Na⁺和K⁺的渗透路径是独立的实体。他们进一步提出，这些路径是大小和选择性不同的蛋白质孔道，并开始称之为“通道”。与此同时，Bean等人及Hladky和Haydon发现，在人工双层膜中加入某些抗生素或蛋白质后，可以观察到离散的、阶梯状的皮安级电流，这被解释为单个孔状结构插入膜中所致。此外，通过分析乙酰胆碱（ACh）激活电流的自发波动（噪声），Katz和Miledi以及Anderson和Stevens估算出单个ACh通道的电导约为20 pS。这些发现逐渐让科学界相信，活细胞膜上确实存在离子通道。

首次单通道记录

直接记录天然通道的电流面临巨大挑战，主要障碍是背景噪声过高。此时，两位年轻的德国科学家Erwin Neher和Bert Sakmann登上了历史舞台。Neher在Munich的Max-Planck-Institut fur Psychiatrie与Sakmann相识，后者当时正计划前往伦敦的Bernard Katz实验室学习。对突触机制的共同兴趣让两人走到一起，他们于1973年在Gottingen的Max-Planck-Institut fur Biophysikalische Chemie重逢并决定合作。

他们采用的方法是：将经过火抛光的玻璃微管（孔径1-2 μm）压在去神经的青蛙肌纤维膜表面，以电隔离出一小片仅含少量活性通道的膜区域。尽管形成的封接电阻仅为50-100 MΩ，但已足以将来自隔离膜的电流信号导入记录电极，并将背景噪声降至可接受水平。

197

1976年，Neher和Sakmann在《自然》杂志上报告了首例来自去神经肌纤维膜片的离散阶梯状电流记录。这些电流被立即解释为流经ACh受体的单通道电流，为细胞膜上存在离子通道提供了确凿证据。尽管这些记录噪声较大，但它们首次实现了在实时条件下观察单个分子在其天然环境中的构象变化。

吉欧封接的形成：膜片钳技术的突破

最初的单通道记录噪声过高，严重限制了其用于严格的生物物理学研究。问题的核心在于封接电阻（R_seal）不足。热噪声（σ_n）的大小由公式σ_n = √(4kTΔf/R)决定，其中R为电阻。对于100 MΩ的封接，在1 kHz带宽下噪声约为0.40 pA（rms），这对于记录仅几皮安的信号而言过高。

转机出现在他们发现通过施加温和的吸吮可轻易形成10-100 GΩ的高阻封接（即吉欧封接）。这一突破使背景噪声降低了一个数量级以上，使得清晰分辨皮安级电流成为可能，并且无需额外微电极即可对膜片进行电压钳制。

吉

吉欧封接的物理化学基础至今未完全阐明，但普遍认为范德华力是主要作用力。当膜与玻璃之间的距离被挤压至仅剩几埃时，其间的水层被排出，形成极其紧密的封接，甚至小分子如ACh都无法通过。

膜片钳的经典构型及其应用

吉欧封接的形成不仅降低了噪声，其机械稳定性也允许进行多种操作，衍生出四种经典构型，各具独特用途。

细胞贴附式（Cell-attached）

这是最初始的构型，稳定且可用于记录膜片上的通道电流。但其主要限制是无法改变膜片两侧的溶液，且无法精确控制细胞膜电位。

内面向外式（Inside-out）

将电极从细胞上快速撤回，可使膜片从细胞上撕裂下来，形成内面向外式膜片。此构型允许通过改变浴槽溶液来调控通道胞质侧的调控因子，是研究由胞内物质（如Ca²⁺）调节的通道（如Ca²⁺激活的K⁺通道）的理想选择。

全细胞式（Whole-cell）

通过施加更强负压破坏膜片，使电极内液与胞质相连。此构型可记录整个细胞所有通道的宏观电流，并允许物质从电极向细胞内扩散。但缺点是胞内重要成分可能被电极液稀释“洗脱”。

外面向外式（Outside-out）

从全细胞构型缓慢撤回电极，可形成外面向外式膜片。其胞外侧暴露于浴槽液，便于研究细胞外调节剂（如神经递质）的作用，但制备过程较为繁琐。

单通道记录的分析

单通道记录可提供两类关键信息：电流幅度和开关状态的停留时间。

幅度直方图的构建

通过绘制所有数字化电流值的点幅度直方图，可以识别通道的关闭水平和一个或多个开放水平（若存在亚电导状态）。各峰下的面积比例代表该状态的停留时间占比，可立即计算出通道在给定条件下的开放概率（P_open）。

动力学的分析

更深入的信息来自动力学分析。单通道电流是随机持续时间的方波脉冲，反映了通道在多个状态之间的随机、瞬时切换。在稳态条件下，通道的停留时间通常呈指数分布。需要指数函数的数量提示了通道可能具有的关闭或开放状态的最少数量。

早期广泛使用的50%幅度阈值法虽然直观，但在严重滤波条件下会遗漏短暂事件，或引入虚假事件，导致参数估计偏差。为此，研究者开发了隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model, HMM）等先进方法，直接对原始数据进行分析，避免了理想化过程带来的误差。

离子通道的动力学行为可以用离散状态马尔可夫模型（Discrete-State Markov models）很好地描述。该模型具有几个基本特性：状态间的转变是瞬时的；速率常数在恒定条件下不变；停留时间呈指数分布；通道不具有记忆性。

单通道记录研究通道门控与渗透性的范例

检验ACh受体的门控机制

对骨骼肌烟碱型ACh受体（nAChR）的研究是单通道记录应用的典范。最初的Del Castillo与Katz模型认为，激动剂ACh结合后，受体-激动剂复合物（AR）直接异构化为开放状态（AR*）。随后的研究揭示了更复杂的图景：剂量反应曲线的正协同性提示存在两个结合位点；通道需先经过“预开放”（primed）中间态（AR'和A₂R'）才能开放；且即使只有一个激动剂分子结合，通道也可能以低概率短暂开放。

通过

通过将基于此Scheme模拟产生的数据与实验记录进行比对，研究者验证了该动力学模型能很好地复现实验观察到的现象：随着ACh浓度升高，关闭时间缩短，开放概率增加，并且开放时间直方图的组成发生特征性变化。

揭示氯离子通道的独特渗透机制

长期以来，氯离子（Cl^-）电流的重要性被低估。利用单通道记录技术，研究者发现小鼠海马神经元的背景Cl^-通道具有约30 pS的电导，其对阴离子的选择性序列（Br^- > I^- > Cl^- > F^-）符合Eisenman理论中的“低场强”位点特征。更令人惊讶的是，该通道对阳离子也具有通透性，P_Na/P_Cl ≈ 0.2。

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-电流的记录及其I-V关系。">

这些看似矛盾的现象通过一个新颖的渗透机制得以解释：该通道的选择性过滤器具有一个负电结合位点。渗透首先是一个阳离子结合于此位点，形成一个低场强偶极子以吸引阴离子。随后形成的“活化复合物”极不稳定，其解离方式决定了电流性质：绝大多数时候是阴离子单独穿过，产生阴离子电流；偶尔阳离子和阴离子会成对解离并穿过通道，从而实现阳离子的跨膜运输。该机制也解释了为何在仅含不通透阴离子SO₄^2-时，无法观察到任何阳离子电流。

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-通道阴阳离子渗透机制示意图。">

结论

单通道记录技术以其多种构型满足了不同的实验需求，在过去几十年中成为无数研究领域不可或缺的工具。尽管存在数据通量低、操作要求高等局限性，但学界普遍认为，由专家操作的经典膜片钳技术仍能提供最高质量的数据，是解答离子通道细微功能问题的金标准。作为最古老的单分子技术，它在过去45年中变化不大，却依然是研究蛋白质构象动力学的里程碑。其无与伦比的记录时长（包含数千次开关事件）和亚毫秒级的时间分辨率，使其成为唯一能在实时条件下、在细胞膜天然环境中直接观察通道构象变化（开关）的技术。