GLP-1受体激动剂反复停药诱发高瘦素血症并加剧肥胖衰老小鼠代谢功能衰退

本研究发现，在衰老肥胖UM-HET3小鼠模型中，利拉鲁肽（Lira）的间歇性使用（ON/OFF组）会引发显著体重循环，导致高瘦素血症、内脏脂肪扩张及瘦体重不可逆流失，进而诱发胰岛素抵抗和代谢功能恶化。该研究警示GLP-1受体激动剂的反复停药可能加剧衰老相关肌少症（sarcopenia）风险，强调持续治疗对维持代谢益处的必要性。

　　

GLP-1受体激动剂反复停药诱导高瘦素血症并恶化肥胖衰老UM-HET3小鼠代谢健康

1 引言

肥胖与多种代谢性疾病密切相关，包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）、心血管疾病和某些癌症。临床观察表明，即使体重减轻5%也能显著改善代谢健康。相比生活方式干预（最多减重10%），胃旁路手术可实现30%–40%的减重，被视为肥胖治疗的金标准。近年来，基于GLP-1的疗法（如司美格鲁肽和替尔泊肽）在临床中实现了接近减重手术的效果，不仅显著减轻体重，还明显改善葡萄糖耐量、胰岛素敏感性，减少MASLD、肝纤维化和心血管事件风险。然而，GLP-1疗法伴随恶心、呕吐、腹泻和腹痛等副作用，且高昂的治疗成本导致部分肥胖患者反复停药和重新用药，形成独特的体重循环模式。其在衰老肥胖个体中的代谢后果尚不明确。

为填补这一空白，本研究利用遗传多样性UM-HET3小鼠模型，模拟人类遗传异质性并增强转化相关性。该模型广泛用于衰老研究，通过美国国家衰老研究所干预测试计划（ITP）识别延长寿命和改善代谢健康的干预措施。8月龄UM-HET3小鼠接受6个月高脂饮食，建立遗传异质、肥胖和衰老模型，以研究利拉鲁肽治疗及其反复停药对代谢的影响。

2 结果

2.1 反复利拉鲁肽停药诱导衰老肥胖小鼠体重循环

目前有多种GLP-1疗法，包括司美格鲁肽、替尔泊肽、利拉鲁肽（Lira）和DPP-4抑制剂。既往研究表明，Lira在饮食诱导肥胖C57BL/6小鼠中引起显著体重减轻。基于此，本研究选择Lira探究反复停药的影响。鉴于GLP-1激动剂作用机制相似，预计司美格鲁肽和替尔泊肽也会在小鼠中诱导类似体重循环。

为更好模拟GLP-1疗法在衰老肥胖个体中的应用，8月龄UM-HET3小鼠接受6个月高脂饮食，建立遗传异质、肥胖和衰老模型。小鼠分为三组：第1组（Lira OFF）仅接受载体（生理盐水）三个4周周期；第2组（Lira ON/OFF）经历3个周期，每周期2周Lira治疗后续2周载体；第3组（Lira ON）连续接受Lira治疗12周。

Lira OFF组小鼠在所有周期中保持稳定体重，无体重减轻。相反，Lira ON组小鼠在第一个周期迅速减重，并在后续周期维持较低体重。有趣的是，Lira ON/OFF组小鼠在每个治疗阶段迅速减重，停药阶段迅速体重回升，形成三个明显的体重循环。尽管各组基线体重相似，Lira ON/OFF组在第一个周期的减重幅度小于Lira ON组，可能源于UM-HET3小鼠的遗传异质性。值得注意的是，在第一个周期，Lira治疗导致显著体重减轻，但停药阶段体重未完全恢复；在第二个周期，减重反应减弱（周期1为8克 vs 周期2为4克），而随后的体重回升更为明显；第三个周期的减重和回升模式与周期2相似。这些结果表明，GLP-1激动剂治疗的疗效随重复给药而减弱，提示潜在耐药性的发展。

2.2 反复利拉鲁肽停药不影响总体食物摄入

Lira OFF组小鼠从周期1到周期3保持一致的每日食物摄入。相反，Lira ON组小鼠在周期1的第一周食物摄入锐减，第二周回归基线水平，周期2和3的食物摄入与Lira OFF组相当，表明在这些后期周期中，减少的食物摄入对其维持较低体重的贡献极小。

Lira ON/OFF组小鼠食物摄入波动显著：每个Lira治疗阶段，摄入减少约1周后回归基线；停药后，食物摄入稳步增加约1周后逐渐正常化。令人惊讶的是，计算每个周期的总食物积累量时，Lira ON/OFF组消耗的食物量与Lira OFF组相同。

这些发现提示，中枢神经系统对长期食物摄入保持严格调控，可能限制食欲抑制干预在较长时间内的有效性，也有助于解释在重复治疗周期中维持体重减轻面临的挑战。

2.3 反复利拉鲁肽停药差异影响瘦体重和脂肪量

GLP-1疗法的一个主要关切是减少瘦体重，可能加剧衰老个体的肌少症。本研究每两周监测脂肪和瘦体重。Lira OFF组保持稳定的脂肪量（绝对克数和占初始脂肪量的百分比）。相反，Lira ON组总脂肪量显著减少，但到周期3观察到脂肪量轻微回升，提示长期治疗可能存在脂肪反弹效应。

最显著的发现出现在Lira ON/OFF组。每个Lira治疗周期导致大量脂肪量减少，随后在停药阶段脂肪量完全恢复。值得注意的是，Lira的减脂效果随时间减弱，周期3的脂肪减少小于早期周期。这些结果提示，反复Lira停药可能导致药物疗效降低，反映衰老肥胖小鼠中药效耐受的发展。正如预期，Lira治疗也引起瘦体重显著减少（绝对克数和占初始瘦体重的百分比）。然而，与脂肪量不同，瘦体重在停药阶段仅部分恢复。

总之，这些发现表明，反复Lira停药完全恢复脂肪量但未能恢复瘦体重，导致身体成分的不利转变，这种不平衡可能促进肥胖衰老小鼠衰老相关肌少症的进展。

2.4 反复利拉鲁肽停药损害代谢健康

鉴于观察到脂肪与瘦体重比率增加，我们探究了反复Lira停药是否会进一步损害这些小鼠的代谢健康。为评估这一点，我们在12周实验结束时对所有三组进行葡萄糖和胰岛素耐量测试。正如预期，与Lira OFF组相比，Lira ON组小鼠表现出显著改善的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。相反，Lira ON/OFF组小鼠具有显著更高的脂肪与瘦体重比率，表现出严重受损的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，表现为葡萄糖和胰岛素挑战后血糖水平升高。

此外，我们检查了脂肪组织和肝脏的炎症标志物。Lira ON组小鼠内脏脂肪组织中炎症标志物表达显著减少，包括Tnfα、IL-1β和F4/80。然而，这种抗炎效应在Lira ON/OFF组完全缺失，表明反复Lira停药未能提供任何持久的抗炎益处。此外，H&E染色组织学分析显示，Lira ON组肝脏脂滴积累大幅减少，这一效应在Lira ON/OFF组完全丧失。同样，肝脏中的炎症标志物，包括Tnfα、IL-1β、Cxcl14和Ccl2，在Lira ON组显著减少，但在Lira ON/OFF组保持升高。这些观察强烈表明，反复Lira停药未能产生任何持久的“代谢记忆”效应。

2.5 脂肪组织和肝脏中的细胞衰老不参与反复利拉鲁肽停药的有害效应

细胞衰老在肥胖和衰老背景下调控代谢健康起关键作用。既往研究表明，肥胖发展过程中内脏脂肪库和肝脏的细胞衰老显著增加。鉴于Lira对内脏脂肪和肝组织的深远影响，我们探究了细胞衰老的变化是否可能是观察到的代谢结果的基础。

为此，我们通过Western blot和RT-PCR分析了内脏脂肪库和肝组织中关键衰老标志物（GPNMB、p53、p21和p16）的表达。令人惊讶的是，尽管Lira ON组脂肪量显著减少，我们未检测到内脏脂肪中衰老标志物表达的任何变化。类似地，在经历反复脂肪减少和恢复周期的Lira ON/OFF组，衰老标志物表达保持不变。在肝脏中，Lira ON组脂肪变性改善并不伴随衰老标志物减少。同样，Lira ON/OFF组与Lira OFF和ON组相比无差异。这些发现提示，脂肪和肝脏衰老不介导反复Lira停药的代谢效应，尽管其他组织如肌肉、胰腺和肠道值得进一步研究。

2.6 反复利拉鲁肽停药促进高瘦素血症驱动代谢损伤

我们先前证明，高瘦素血症促进饮食诱导肥胖，且瘦素减少对GLP-1诱导的减重至关重要。在此，我们探究了瘦素是否在反复Lira停药观察到的代谢损伤中起作用。为此，我们在治疗前、期间和之后测量了循环胰岛素、脂联素和瘦素。

Lira治疗显著降低胰岛素水平。在Lira ON/OFF组，胰岛素水平随治疗波动：Lira给药期间下降，停药后回归基线，与Lira OFF组匹配。脂联素水平未显示一致模式，似乎需要长期治疗才能升高，仅在Lira ON组56天后增加。Lira ON/OFF组与Lira OFF相比无显著变化，提示脂联素稳定且对短期体重波动无反应。

然而，瘦素表现出独特动态。Lira OFF组小鼠在整个研究中保持稳定的瘦素水平。相反，Lira ON组在周期1瘦素显著减少，随后在周期2和3逐渐增加，尽管体重仅轻微回升。最值得注意的是，Lira ON/OFF组显示循环瘦素进行性上升，经过三个治疗周期达到高瘦素血症。我们认为这一上升可能促成观察到的代谢损伤。我们还分析了脂联素/瘦素比率，一个公认的代谢健康标志物，发现其在初始增加后随时间在Lira ON和Lira ON/OFF组下降。到第三个周期，Lira ON/OFF组的比率甚至低于Lira OFF组，与该组观察到的受损代谢结果一致。

由于瘦素减少对GLP-1诱导的减重必要，我们计算了各周期瘦素减少的百分比。瘦素减少的程度从周期1到周期3减弱，反映了随时间减少的体重减轻。

为探究高瘦素血症的来源，我们评估了内脏脂肪中Lep基因表达。Lep表达在Lira ON/OFF组最高，而AdipoQ表达保持不变。此外，到第三个周期结束时，Lira ON/OFF组的内脏脂肪量显著大于Lira OFF组，支持高瘦素血症与内脏脂肪扩张之间的联系。

3 讨论

使用衰老、肥胖和遗传异质的UM-HET3小鼠模型（更好反映人群复杂性），我们关于反复利拉鲁肽停药效应得出几个关键观察。与连续给药相比，利拉鲁肽治疗和停药的反复周期诱导了某种形式的药物耐受，证据是随时间的推移体重减轻和脂肪量减少逐渐降低。这种减弱疗效伴随放大的胃肠道副作用，表现为从周期1到周期3对急性利拉鲁肽给药的食品摄入反应逐渐降低。重要的是，反复停药损害整体代谢健康，并似乎增加发展肥胖和衰老相关肌少症的风险。这些有害结果可能由逐渐增加的瘦素水平或高瘦素血症介导。鉴于所有GLP-1受体激动剂，包括司美格鲁肽、替尔泊肽和利拉鲁肽，主要通过脑中Glp1r表达神经元调节饱腹感和食物摄入，我们预期本研究中利拉鲁肽观察到的效应也广泛适用于其他GLP-1R激动剂。

尽管体重循环在饮食限制和再喂养等背景下已被广泛研究，但GLP-1诱导的体重循环在机制上似乎不同。与GLP-1疗法相关的一个主要关切是瘦体重减少，临床研究中已有充分记录。在我们的模型中，利拉鲁肽给药导致脂肪和瘦体重显著减少。然而，尽管脂肪量在停药期间完全恢复，但瘦体重恢复仅部分。脂肪相对于瘦组织的不成比例恢复提示，停止GLP-1疗法的个体可能比从未开始治疗的个体面临增加的肌少症风险。这些发现引发重要临床考虑，因为它们表明GLP-1基疗法的间歇使用可能加剧代谢脆弱性而非改善它。因此，长期治疗承诺可能是维持益处所必需，临床医生在处方这些疗法时应仔细权衡这些长期影响。

为探究反复停药有害效应的机制，我们考虑了脂肪组织中反复体重减轻和恢复是否可能诱导细胞衰老，导致炎症和其他代谢功能障碍。然而，我们对脂肪组织和肝脏中衰老标志物的分析显示跨治疗组无显著差异，提示这些组织中的细胞衰老不是观察到的代谢损伤的主要驱动因素。尽管如此，这并不排除其他组织（如骨骼肌、胰腺或肠道）中的衰老有助于受损的瘦体重恢复和肌少症发展。相反，我们的发现强烈指向改变的脂肪因子信号，特别是涉及瘦素，作为观察效应的关键介质。我们和其他人先前表明，高瘦素血症不仅是生物标志物，还是饮食诱导肥胖的因果因素。而且，瘦素减少对GLP-1疗法的减重效应必要。我们当前的结果与这一模型一致：反复利拉鲁肽停药导致循环瘦素减少逐渐减弱，平行于连续周期中逐渐降低的体重减轻。此外，我们观察到内脏脂肪中Lep基因表达增加和循环瘦素水平升高，可能通过旁分泌或自分泌机制驱动内脏脂肪扩张。这种内脏脂肪扩张发生在总体体重稳定或仅轻微增加的背景下，提示身体成分向 favoring 肥胖而非瘦组织的转变。近期研究表明，脂肪细胞可能保留“致肥记忆”，在重新暴露于致肥刺激时引发病理反应。我们在利拉鲁肽停药期间的观察，以快速脂肪恢复、持续高瘦素血症和受损代谢标志物为特征，与这一概念一致，并提示改变的脂肪因子分泌，包括持续升高的瘦素，可能是这种记忆效应的基础。

真实世界使用GLP-1R激动剂的人群中已记录高停药率。然而，频繁治疗中断的代谢后果尚未在人群中进行系统研究。未来研究需要评估反复停药在人类中是否导致类似风险，包括肌少症和改变的脂肪因子谱。

总之，我们的发现证明，反复利拉鲁肽停药促进高瘦素血症，损害代谢健康，并加速衰老和肥胖相关肌少症的发展。这些结果表明，应考虑基于GLP-1疗法的持续而非间歇使用，从一开始确保持续的代谢益处。

4 材料和方法

4.1 小鼠模型

所有动物程序经圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。雄性UM-HET3小鼠（每笼4-5只）通过NIA赞助的干预测试计划（ITP）在圣安东尼奥站点获得。繁殖方法先前已描述并在此简要总结。UM-HET3小鼠是CByB6F1母亲（JAX stock #100009）和C3D2F1父亲（JAX stock #100004）的后代。来自第二或更晚窝次的小鼠，在六个月间隔内生产，断奶 into 每笼4-5只雄性，并在标准实验室条件（12小时光/暗循环；灯早7点开）下维持在温度控制（22°C）环境中，自由获取食物和水。

4.2 小鼠治疗

在8月龄时，小鼠接受高脂饮食（Bio-Serv，60%脂肪）6个月。具有可比体重和食物摄入的小鼠然后分配到三组，并每日腹腔注射载体（生理盐水）或利拉鲁肽（0.01 mg/kg体重）。在整个治疗期间监测体重和食物摄入。身体成分使用EchoMRI评估。相同实验已重复两次。

4.3 口服葡萄糖和胰岛素耐量测试

在三个治疗周期后，如先前所述在12周治疗结束时进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT）和腹腔胰岛素耐量测试（ITT）。然后处死小鼠，并从下腔静脉收集血液。肝脏用PBS灌注，肝脏和脂肪组织解剖并称重。血液样本在室温凝血，2000×g离心10分钟在4°C，血清上清液在液氮中闪冻并存储在?80°C。组织样本或速冻或福尔马林固定用于进一步分析。使用ELISA试剂盒（Crystal Chem）测量血清胰岛素、脂联素和瘦素。

4.4 RNA分离、RT-qPCR和RNAseq

RNA提取和分析如先前所述进行。简言之，使用TRIzol试剂（Invitrogen, Cat# 15596026）提取总RNA并通过异丙醇沉淀纯化。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific）测定RNA浓度。对于RT-qPCR，1 μg RNA使用H