柔性环N-(3-氧代丁基)杂环的对映互补性生物还原为药物发现提供高药物相似性的手性片段

本综述系统探讨了利用对映互补性重组醇脱氢酶（ADHs）实现柔性环N-(3-氧代丁基)杂环化合物的生物还原，成功制备了对映体纯的(S)-和(R)-醇（ee > 99%）。研究通过野生型酵母和重组ADHs（如RaADH和LkADH）全细胞催化，展示了高效、高选择性的生物转化策略，为基于片段的药物发现（FBDD）提供了具有高“3D”特性及药物相似性的重要手性砌块，拓展了生物催化在手性合成中的应用前景。

　　

1 引言

大多数活性药物成分（APIs）是sp²富集的刚性分子，但研究表明，更高饱和度的“3D”分子在药物开发过程中更具优势。分子形状多样性对分子库的全面生物活性至关重要，因此基于片段的药物发现（FBDD）利用多样化的化学支架和功能团覆盖化学空间，成为一种有效的识别新化学先导物的方法。FBDD聚焦于创建更小（< 20个重原子）、多样化的简单分子集合，这些分子与靶标有弱相互作用，并可能遵循“三规则”（分子量?

FDA批准的小分子APIs中，84%含有至少一个氮原子，59%含有氮杂环。哌啶是最丰富的杂环，出现在72种独特APIs中，例如抗胆碱药Flavoxate。更具体地，4-甲基哌啶部分出现在抗凝药阿加曲班中，4-苄基哌啶和乙基哌啶-4-羧酸酯部分分别存在于抗组胺药非索非那定和抗蠕动药地芬诺酯中。哌嗪是第三常见的氮杂环，出现在59种分析的APIs中，例如含有4-甲基哌嗪部分的酪氨酸激酶抑制剂博舒替尼。吡咯烷是第五丰富的，出现在37种APIs中，例如Janus激酶抑制剂菲达拉替尼。在分析的APIs中，吗啉是第17位最常见的杂环，存在于12种独特APIs中，例如表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂吉非替尼。四氢异喹啉是第19位最丰富的氮杂环，出现在11种分析的APIs中，例如ACE抑制剂喹那普利。硫代吗啉未进入前25名，但仍出现在一种API中，即抗寄生虫药硝呋莫司。

本研究考察的九种杂环中，四种是基于哌啶的[哌啶(4c)、4-甲基哌啶(4d)、4-苄基哌啶(4e)和乙基哌啶-4-羧酸酯(4f)]，其余五种[吗啉(4a)、硫代吗啉(4b)、吡咯烷(4g)、4-甲基哌嗪(4h)和四氢异喹啉(4i)]也包含五元或六元饱和环，或部分饱和的稠环系统(4i)。这些杂环含有多个sp³杂化碳原子，导致非平面（“3D”）结构。从这些杂环出发，通过与甲基乙烯基酮(5)的氮杂迈克尔反应，可以制备前手性N-(3-氧代丁基)杂环。在合成药学相关分子过程中，对此类酮的对映选择性生物还原步骤可以产生对映体纯的仲醇，这些醇是合适的构建块，用于将这些类药的杂环3D片段纳入目标结构。

手性化合物是APIs合成中的重要中间体和构建块，其中对映体纯度由于药品监管机构的严格要求而至关重要。不对称仲羟基功能出现在许多药物中，例如NK1受体拮抗剂阿瑞匹坦、β受体阻滞剂普萘洛尔或HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀。因此，将前手性N-(3-氧代丁基)杂环转化为相应的对映体纯手性醇，产生了具有高类药性的有前景的手性片段。例如，中枢性镇咳药Fedrilate（由比利时联合化工（UCB）作为黏液溶解剂专利）含有4-吗啉丁-2-醇部分。此外，同一部分可以在实验分子（化合物193）中找到，该分子在体外抗肿瘤活性试验中对名古屋大学胃癌-3（NUGC-3）细胞系显示出1.2?μM的IC₅₀值。

近年来，酮还原酶（KREDs，也称为醇脱氢酶，ADHs）的应用在商业、工业规模的对映体纯手性醇合成中成为广泛认可的做法。为了开发合成可行、高转化的KRED催化过程，需要有效的辅因子再生，以便昂贵的辅因子（NADH或NADPH）可以回收。许多辅因子再生系统已被描述，例如使用2-丙醇、葡萄糖或乳糖作为还原形成的NAD⁺或NADP⁺的共底物。也许最直接的选择是利用全细胞系统，使用廉价且易于处理的2-丙醇作为共底物，它被相同的KRED转化为丙酮，同时辅因子被再生。这种方法也确保了生物还原的易放大性。

全细胞生物催化剂还原酮是一种高效技术，原因有几个。全细胞野生型酵母菌株是生物合成酮还原中有用的生物催化剂，确保其内在辅因子（NADH或NADPH）的再生在其全细胞中以高效方式进行。KREDs无疑是有价值的生物催化剂，因为各种(S)-和(R)-选择性KREDs在药物和其他高价值产品的合成中已经看到工业应用。例如，来自 Rhodococcus aetherivorans 的醇脱氢酶（RaADH）是一种优秀的生物催化剂，它接受多种酮作为底物，以高对映体纯度生产(S)-醇。另一个例子是来自 Lactobacillus kefir 的醇脱氢酶（LkADH），它已成为一种可靠且高效的生物催化剂，具有广泛的底物范围，用于生产(R)-醇。

本研究的目标是通过对包含柔性N-杂环的酮进行对映互补性生物还原，获得具有不对称醇功能的对映体纯手性“3D”片段[(S)-1a–i或(R)-1a–i]——这些片段可用于FBDD——应用各种具有酮还原酶活性的生物催化剂（方案1）。这一概念在文献中 surprisingly 很少例证。因此，我们的研究旨在：1）对包括面包酵母在内的多种野生型酵母菌株对一系列具有前手性羰基的柔性N-杂环（在N-(3-氧代丁基)侧链中）进行酮还原酶活性的初步评估；2）利用对映互补性醇脱氢酶（RaADH和LkADH）生产相应醇的(S)-和(R)-对映体；3）在制备规模进行生物还原以分离和表征对映体纯产物。

这些对映体纯的(S)-或(R)-具有不对称羟基功能的3D杂环可以作为手性FBDD库的成员，以及制备APIs的潜在构建块。从相应的柔性杂环（HC）出发，经过氮杂迈克尔加成反应，获得前手性酮。借助对映互补性KREDs [(S)-或(R)-KREDs]，介导对映选择性还原（ESR）反应，可以制备柔性杂环醇片段的两个对映体，并用作手性FBDD库中的潜在构建块。根据3D杂环上反应位点的可用性，这些片段可以仅在醇功能处延伸，或可用作中心片段。

2 实验部分

2.1 化学品

（部分）饱和杂环、试剂和溶剂购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）、Merck KGaA（德国达姆施塔特）和Molar Chemicals（匈牙利Halásztelek）。

2.2 全细胞醇脱氢酶制剂

2.2.1 冻干酵母全细胞制剂

酵母菌株的发酵和冻干如前所述。关于酵母生物催化剂的更多细节可在支持信息的S1.3节中找到。

2.2.2 重组全细胞醇脱氢酶制剂

本研究中使用的重组KREDs [来自 Rhodococcus aetherivorans 的(S)-选择性醇脱氢酶（RaADH）和来自 Lactobacillus kefir 的(R)-选择性醇脱氢酶（LkADH）]已在各种底物上进行了全面研究，包括生物还原的优化。LkADH（Uniprot ID: Q6WVP7）和RaADH（Uniprot ID: N1MBR5；后来被A0AAT8XUI2条目取代，代表与N1MBR5相比的M222K突变体）的密码子优化基因从GenScript（荷兰Rijswijk）购买。这些基因被放入带有NdeI和BamHI限制酶位点的pET19b载体中。通过热激法将质粒转化到大肠杆菌（E. coli）BL21菌株中。转化细胞在5?mL LB培养基（胰蛋白胨，50?mg；酵母提取物，25?mg；NaCl，50?mg；pH?=?7.0）中生长过夜，37?°C，180?rpm，并补充有羧苄青霉素（50?μg?mL^?1）。对于蛋白质表达，将250?mL自动诱导培养基（Na₂HPO₄，1.5?g；NaH₂PO₄，0.75?g；胰蛋白胨，5?g；酵母提取物，1.25?g；NaCl，1.25?g）和10?mL碳补充溶液（甘油，1.89?g；葡萄糖，125?mg；乳糖，500?mg）接种1?mL过夜培养物。培养物在37?°C，180?rpm下振荡16?h（通常达到OD₆₀₀≈1）。细胞在4?°C，2500?g下离心20?min分离。分离后，将细胞重悬于10?mL磷酸盐缓冲液（pH?=?7.5，50?mM）中，并再次以先前设置离心。细胞沉淀（通常≈1.6 g湿重）重悬于10?mL磷酸盐缓冲液（pH?=?7.5，50?mM）中，并直接用于生物催化。

2.3 分析方法

NMR谱在氘代溶剂中记录（游离碱 case 为CDCl₃，盐酸盐 case 为DMSO，哌嗪二盐酸盐 case 为D₂O），使用Bruker DRX-500谱仪，¹H操作频率为500?MHz，¹³C为126?MHz。NMR信号以ppm为单位在δ标度上给出。红外（IR）光谱在Bruker ALPHA FT-IR光谱仪上记录（ATR模式），波段波数列出为cm^?1。旋光度在Perkin-Elmer 241旋光仪上测量，使用汞的578?nm线和钠的D线（589?nm）。该旋光仪通过测量薄荷醇两种对映体进行校准。薄层色谱（TLC）在预涂TLC ALUGRAM Xtra SIL G/UV254板（Macherey & Nagel）上进行；斑点通过在紫外光（254或365?nm）下观察和/或磷钼酸染色显色。柱色谱使用Geduran Si 60（Merck）硅胶进行。气相色谱（GC）用于测定生物还原中从酮2a–i形成醇(S)-或(R)-1a–i的转化率和对映体过量。GC分析使用Agilent 4890?GC，配备火焰离子化检测器（FID）和Hydrodex β-6TBDM柱[25?m?×?0.25?mm?×?0.25?μm薄膜，含有七(2,3-二-O-甲基-6-O-叔丁基二甲基硅基)-β-环糊精；Macherey & Nagel（德国Düren）；H₂载气（进样器：250?°C，检测器：250?°C，柱前压：12?psi，分流比：50:1）]和Agilent 5890?GC，配备FID检测器和HP-5柱[30?m?×?0.25?mm?×?0.25?μm薄膜，含有(5%-苯基)甲基聚硅氧烷；Agilent Technologies（美国加利福尼亚州圣克拉拉）；H₂载气（进样器：250?°C，检测器：250?°C，柱前压：15?psi，分流比：50:1）]。温度程序和保留时间包含在支持信息中（表S2）。

2.3.1 通过GC测定生物还原中酮2a-i的转化率

为测定酮2a-i生物还原的转化率，从反应混合物中取样（100?μL）。这些样品用EtOAc（1000?μL）萃取，分离有机层并在硫酸钠上干燥。倾析的EtOAc萃取物直接分析。由于从相应酮2a–i得到的醇1a–i具有相同碳原子数和非常相似的摩尔质量，因此假定醇对酮的摩尔响应因子（配备FID检测器的GC）为1。由于模型化合物2a的三次重复实验表明变异在2%以内，因此进一步实验以单系列进行。

2.3.2 通过GC测定生物还原中醇(S)-或(R)-1a–i的对映体过量

为测定生物还原中形成醇(S)-或(R)-1a–i的对映体过量，将新鲜蒸馏的乙酰氯（10?μL）加入按第3.3.1节所述获得的样品中，酰化在室温下进行1分钟以得到所需的乙酰化醇。过量酰化剂用水（10?μL，室温，一分钟淬灭时间）淬灭，有机相在硫酸钠上干燥，倾析的EtOAc萃取物直接分析。

2.4 底物和参考化合物的化学合成

新化合物的分析数据列于下方，而已知化合物的分析数据包含在支持信息中。N-(3-氧代丁基)杂环2a, c–e, g–i和外消旋N-(3-羟基丁基)杂环(±)-1a–e, g–i的光谱数据可在（支持信息的S1.1.和S1.2.节 respectively；支持信息）中找到。

2.4.1 N-(3-氧代丁基)杂环2a-i的合成

向冷却（?5?°C）的相应（部分）饱和杂环（4a–i，15 mmol）在干乙醚（20?mL）中的溶液中，滴加甲基乙烯基酮（5，19.5?mmol，1.3?eq.，在10?mL干乙醚中）溶液，约30分钟加完。所得混合物允许升至室温，然后再搅拌30分钟。随后，向反应混合物中滴加2?eq. 20% HCl的EtOAc溶液，以沉淀这些化合物的盐酸盐（2a–g, i）或二盐酸盐（2h）。过滤沉淀，用乙醚（3?×?20?mL）洗涤，并在真空下干燥，得到所需产物。已知N-(3-氧代丁基)杂环2a, c–e, g–i的特征数据在支持信息的S1.1.节中给出。

4-硫代吗啉丁-2-酮盐酸盐，2b：白色晶体（85%产率）；Rf?=?0.60（二氯甲烷/MeOH/NH₄OH 10:1:0.2）；熔点：155?°C；¹H NMR (DMSO-d₆, 500?MHz) δ 11.40 (s, 宽, 1H, N⁺H), 3.63 (d, J?=?12.4?Hz, 2H, CH₂), 3.26–3.21 (m, 4H, 2?×?CH₂), 3.09 (t, J?=?7.3?Hz, 4H, 2?×?CH₂), 2.78 (d, J?=?14.0?Hz, 2H, CH₂), 2.14 (s, 3H, CH₃)；¹³C NMR (DMSO-d₆, 126 MHz) δ 205.1 (C?=?O), 53.0 (2?×?CH₂), 51.0 (CH₂), 36.6 (CH₂), 29.9 (CH₃), 23.8 (2?×?CH₂)；IR (KBr): ν (cm^?1) 2531 (νN⁺H), 1713 (νC?=?O), 672 (νC–S)。

乙基1-(3-氧代丁基)哌啶-4-羧酸酯盐酸盐，2f：白色晶体（85%产率）；Rf?=?0.69（二氯甲烷/MeOH/NH₄OH 10:1:0.2）；熔点：136?°C；¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.98 (s, 宽, 1H, N⁺H), 4.08 (q, J?=?7.1 Hz, 2H, CH₂), 3.41 (d, J?=?12.0 Hz, 2H, CH₂), 3.19–3.14 (m, 2H, CH₂), 3.08–3.06 (m, 2H, CH₂), 2.91 (q, J=?10.0 Hz, 2H, CH₂), 2.61–2.56 (m, 1H, CH)；2.14 (s, 3H, CH₃), 2.02–2.00 (m, 2H, CH2), 1.95–1.89 (m, 2H, CH₂), 极1.18 (t, J?=?7.1 Hz, 3H, CH₃)；¹³C NMR (DMSO-d₆, 126 MHz) δ 205.1 (C?=?O), 172.9 (COOR), 60.3 (CH₂), 50.8 (2?×?CH₂), 50.3 (CH_{2), 37.9 (CH), 36.9 (CH2), 29.9 (CH3) 25.1 (2?×?CH2), 14.0 (CH3)；IR (KBr): ν (cm^?1) 1732 (νC?=?O), 1716 (νC?=?O)。}

2.4.2 外消旋N-(3-羟基丁基)杂环(±)-1a–i的合成

将相应酮（2a–i，2?mmol）在MeOH（对于2a–e, g–i）或EtOH（对于2f）（5?mL）中的溶液冷却至?5?°C，然后分批次（约30分钟）将硼氢化钠（5?mmol，2.5?eq. ((±)-1a–g, i)；7?mmol，3.5?eq. ((±)-1h)）加入上述搅拌溶液中。所得混合物允许升至室温，然后再搅拌30分钟。反应混合物在真空中蒸发，用二氯甲烷（30?mL）稀释，并用水（3?×?30?mL）洗涤。有机相在硫酸钠上干燥，并在真空蒸发器中浓缩，得到所需产物。已知N-(3-羟基丁基)杂环(±)-1a–e, g–i的特征数据在支持信息的S1.2.节中给出。

乙基1-(3-羟基丁基)哌啶-4-羧酸酯，(±)-1f：无色液体（74%产率）；Rf?=?0.76（二氯甲烷/MeOH/NH₄OH 10:极1:0.2）；¹H NMR (CDCl₃, 500?MHz) δ 4.11 (q, J?=?7.1?Hz, 2H, CH₂), 3.96–3.90 (m, 1H, CH), 3.10–3.05 (m, 1H, CH₂), 2.85–2.80 (m, 1H, CH₂), 2.65–2.59 (m, 1H, CH₂), 2.56–2.52 (m, 1H, CH₂), 2.32–2.28 (m, 1H, CH), 2.24–2.18 (m, 1极H, CH₂), 1.93–1.89 (m, 3H, 2?×?CH₂), 1.80–1.72 (m, 2H, CH₂), 1.66–1.58 (m, 1H, CH₂), 1.50–1.45 (m, 1H, CH₂), 1.23 (t, J?=?7.1 Hz, 3H, CH₃), 1.15 (d, J?=?6.2 Hz, 3H, CH₃)；¹³C NMR (CDCl₃, 126?MHz) δ 174.8 (COOR), 69.7 (CH), 60.5 (CH₂), 58.0 (CH₂), 52.1 (2?×?CH₂), 33.5 (CH₂), 28.4 (2?×?CH₂), 28.0 (CH) 23.5 (CH₃), 14.3 (CH₃)；IR (KBr): ν (cm^?1) 3271 (νOH), 2930 (ν_asCH₂), 1729 (νC?=?O), 1448 (δ_asCH₃), 1373 (δ_sCH₃), 1260 (ν_asC–O–C), 1122 (νC–O)。

2.5 使用重组全细胞醇脱氢酶筛选N-(3-氧代丁基)-杂环2a–i生物还原为(S)-或(R)-N-(3-羟基丁基)杂环[(S)-或(R)-1a–i]

将表达醇脱氢酶（RaADH或LkADH）的重组E. coli细胞作为全细胞悬浮液（150?μL）加入磷酸钠缓冲液（760?μL，pH?=?7.0，64?mM）中。向悬浮液中加入共底物2-丙醇（40?μL）和酮底物2a–i的溶液（50?μL，来自c?=?1?M在相同磷酸缓冲液中的储备溶液）。这样混合物最终体积为1000?μL，共底物浓度为4?V/V%，底物浓度为50?mM（7.1至12.3?mg?mL^?1，取决于底物的摩尔质量）。所得混合物在30?°C下以700?rpm振荡24?h。样品制备方法同上。

2.6 在制备规模将N-(3-氧代丁基)杂环2a–f, i生物还原为(S)-N-(3-羟基丁基)杂环[(S)-1a–f, i]

在20?mL小瓶中，将RaADH全细胞悬浮液（1.5?mL）用磷酸钠缓冲液（7.6?mL，pH?=?7.0，64?mM）稀释。向悬浮液中加入共底物2-丙醇（400?μL