利用烟草挥发性化合物吸引Telenomus remus：一种针对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的生物防治新策略

本研究系统探讨了卵寄生蜂Telenomus remus对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）卵挥发物（SEVs）和产卵诱导植物挥发物（OIPVs）的趋性行为。通过GC-MS鉴定和Y型嗅觉仪实验，发现芳樟醇（Linalool）、二十三烷（Heneicosane）等6种化合物及其二元组合能显著吸引寄生蜂。研究为开发基于挥发性有机化合物（VOCs）的绿色防控技术提供了重要依据，对促进农业害虫综合治理（IPM）具有实践意义。

　　

1 引言

寄生蜂利用挥发性有机化合物（VOCs）定位食物来源和产卵场所，这些化合物主要是虫害诱导植物挥发物（HIPVs），作为间接防御机制吸引害虫的天敌。卵寄生蜂常以产卵诱导植物挥发物（OIPVs）作为可靠线索定位隐蔽宿主。此外，寄生蜂还能利用宿主卵释放的利它素（kairomones）近距离识别宿主。在复杂的化学混合物中，只有少数化合物具有生态相关性，因此识别吸引天敌的具体化合物对于调控三元营养相互作用至关重要。合成挥发物的使用可以增强对寄生蜂的吸引力，多项研究表明化合物组合比单一化合物更有效，因为它们能提供更接近自然的嗅觉背景。

挥发性有机化合物（VOCs），特别是合成VOCs，是传统化学农药的可持续且环保的替代品。这些信息化合物通过模拟天然植物信号吸引寄生蜂和捕食者等天敌，在生物害虫防治中发挥关键作用。由于其高度特异性，VOCs可以调节某些昆虫行为，如宿主定位和产卵，最大限度地减少对非目标生物的意外影响并保护生态完整性。

卵寄生蜂是生物害虫防治中的关键作用因子，以草食性昆虫卵为靶标，从而防止后续幼虫阶段造成损害。为了找到合适的产卵地点，这些寄生蜂依赖一系列感官线索，包括视觉、植物释放的挥发物和宿主衍生的化学特征。除了空气传播的线索外，接触化学感受也起着至关重要的作用，因为寄生蜂可以检测草食动物在取食或运动过程中留在植物表面的表皮碳氢化合物残留物。这些化学痕迹作为接触利它素，提供有关宿主存在的可靠信息，并提高宿主搜索的效率。

斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是一种高度破坏性的多食性害虫，攻击多种经济重要作物，如烟草、棉花、玉米、大豆和花生。幼虫从幼苗到早期生殖阶段都会攻击植物。反复侵扰导致各农业地区作物损失25%至100%。合成杀虫剂的密集和长期使用导致对多种化学类别的广泛抗性，包括拟除虫菊酯、有机磷酸酯、氨基甲酸酯和有机氯化合物，削弱了传统害虫控制策略的有效性。

Telenomus remus是鳞翅目害虫的有效卵寄生蜂，特别是Spodoptera属物种。尽管它最初被描述为草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的寄生蜂，但斜纹夜蛾已被证明是大规模繁殖的更合适宿主。其高繁殖能力、雌性偏向的性别比例、对某些杀虫剂的抗性以及在实验室中易于饲养的特点，使T. remus成为IPM计划中有希望的候选者。然而，在斜纹夜蛾继续造成重大经济损失的烟草农业生态系统中，T. remus并未得到使用。这种有限的使用主要是由于缺乏对影响寄生蜂宿主搜索行为的挥发性有机化合物（VOCs）的详细了解。

2 材料与方法

2.1 植物处理

烟草种子播种在圆柱形塑料盆中，盆中填充四分之三的土壤和肥料混合物。植物在标准实验室条件下培养。当幼苗长到10厘米高时用于实验。植物处理包括健康植物、自然产卵处理和人工接种卵处理。为避免挥发性植物特征被卵中提取的化合物污染，在自然产卵和人工接种期间，都用细刷小心去除卵块，然后收集挥发性样品。

2.2 昆虫饲养

斜纹夜蛾卵块从植物保护研究所收集，并在25°C±1°C下保存在塑料袋中直至孵化。新出现的幼虫用人工饲料喂养，直到达到五龄。五龄幼虫然后转移到类似大小的塑料盒中，盒中有湿润的土壤以防止干燥并促进化蛹。成虫在圆柱形铁丝网笼中饲养，喂食10%蜂蜜溶液。

寄生蜂T. remus从北京智辉虫生物技术有限公司获得，并在气候室中饲养。新出现的成虫提供10%蜂蜜溶液。4小时后，用二氧化碳麻醉寄生蜂1分钟，根据触角形态分离性别。对未经历和经历过的T. remus雌蜂测试四种处理的粗提物，以比较先天和学习的嗅觉反应。未经历过的雌蜂未暴露于斜纹夜蛾卵，而经历过的雌蜂在测定前暴露于卵24小时。使用Y型嗅觉仪的所有实验均使用24-48小时大的雌蜂进行，以确保行为一致性。

2.3 顶空挥发性收集和GC-MS分析

使用动态顶空收集系统收集斜纹夜蛾卵、有自然产卵的烟草植物、接种卵的烟草植物和未受损烟草植物的挥发物。根据先前研究的时间点，在产卵后36、60和84小时收集自然产卵和手动引入卵块的植物挥发物，并在手动引入卵后24、48和72小时收集。所有Y型管组件连接过夜以清洁空塑料释放的化学物质。第二天，连接植物并在连接含有Porapak的柱子之前静置2小时，以避免不必要的污染。在挥发性收集期间，用聚乙烯袋覆盖的植物在盆中心密封 airtight。根部气流被容器顶部包裹的铝箔阻挡。空气在封闭系统中以200 mL/min的速率由大气采样泵泵送。连接含有Porapak Q的吸附柱。连续收集10小时后，用1 mL己烷从Porapak Q过滤器洗脱挥发物。提取的溶液在-20°C下储存直至生物测定测试。从斜纹夜蛾卵收集挥发物的程序与植物处理相同。每次收集使用150克卵。使用Shimadzu单四极杆气相色谱仪与质谱联用（GC-MS-QP2010 SE）分析每种处理的粗提物。使用NIST17在线库鉴定合成化学物质的化学谱。

2.4 Y型嗅觉仪测定

使用Y型嗅觉仪测定评估未经历和经历过的T. remus雌蜂对斜纹夜蛾卵块粗挥发性提取物（SEVs）、手动引入斜纹夜蛾卵诱导的植物挥发物（MEIPVs）、成年斜纹夜蛾雌虫在植物上产卵（OIPVs）和健康烟草植物（HPVs）的粗挥发性提取物的行为反应。相比之下，涉及GC-MS分析鉴定的合成化合物的行为测定仅使用未经历过的寄生蜂进行。这一决定基于先前的观察，即未经历和经历过的雌蜂对粗挥发性提取物的反应没有显著行为差异。主要目标是识别影响T. remus行为的四种处理中的化学化合物。

玻璃管嗅觉仪由一个长10厘米、内径2厘米的主管组成，分支成两个等长（10厘米）的臂，呈60°角。每个臂连接一个长5厘米、内径1厘米的玻璃适配器。Y型管设置的所有部分都与特氟龙管互连。为确保清洁气流，外部空气用活性炭净化，然后通过自来水瓶加湿。每个臂的流速设置为500 mL/min。荧光灯放置在不锈钢灯室（100×80×80厘米）的顶部中心，以确保均匀的光分布。

每种粗提物用1 mL己烷从Porapak Q洗脱。合成化合物在己烷中稀释至所需浓度（1、10、100和100 ng/μL）。对于每次测定，将10 μL测试溶液施加到2×2厘米的滤纸上，以确保样品中有足够质量的挥发性化合物。立即将滤纸放在嗅觉仪的一个臂上，而将带有对照的滤纸放在对面臂上。对于粗提物测定，健康植物挥发物作为对照，而对于合成化合物，仅使用己烷作为对照。刺激物以500 mL/min的恒定气流速率传递到嗅觉仪臂。将寄生蜂单独引入Y型管，引入寄生蜂后关闭测试室；5分钟后，打开室，根据Y型管上指示的位置记录寄生蜂的选择或无选择。如果寄生蜂越过两臂交叉点约5厘米处的线，则计为选择；否则，标记为无响应者。每五只寄生蜂后改变臂的位置以避免位置偏差。测试15只寄生蜂后，所有仪器更换为新的。每次测试使用90只寄生蜂，每只雌蜂视为一个重复。实验结束时，所有设备用蒸馏水清洗并用75%乙醇清洁，然后将所有玻璃设备在100°C下干燥30分钟，以最小化残留气味对下一次使用的影响。实验在白天（上午10点至下午5点）进行。未做出选择的蜂被排除在分析之外。

2.5 合成挥发性化学物质

从GC-MS鉴定的化学物质中总共选择了26种化学物质用于Y型嗅觉仪测定，基于它们的生态相关性、文献支持和可用性。先前报道，来自草地贪夜蛾雌虫腹尖的利它素（Z）-9-十二碳烯-1-醇乙酸酯（Z-9-DDA）吸引T. remus，而来自未受损玉米植物的芳樟醇和吲哚等化学物质也引起寄生蜂的行为反应。这些结果支持针对目标害虫控制的T. remus化学感应反应研究。在当前研究中，每种化学物质最初以10 ng/μL的浓度进行测试，该剂量被认为是中等且适合初步筛选的，因为它可以引起电生理反应而不会对寄生蜂产生驱避作用。

在初步筛选中显示对寄生蜂有显著吸引力的化合物随后在四个系列稀释浓度（1、10、100和1000 ng/μL）下进行测试，遵循先前研究的协议，以确定引起最强行为反应的浓度。对每种测试化合物显示较高吸引力的浓度进一步用于配制二元和三元组合。用于二元和三元组合的最佳浓度是芳樟醇和二十三烷为1 ng/μL，其余化合物为10 ng/μL。由于植物自然释放挥发性有机化合物作为复杂混合物，模拟这种生态背景以有效吸引草食动物的天敌至关重要。因此，在个体测定中引起最高寄生蜂吸引的浓度被视为最佳浓度，随后用于配制二元和三元混合物。先前报道，1 μg/μL浓度的合成化学物质用作二元组合的最佳浓度。二元化合物以1:1的比例配制，而三元混合物以2:1:1的比例配制。将10 μL化学样品混合物加载到滤纸（2×2厘米）上，然后放入Y型管的处理臂中。相同量的己烷放入另一臂作为对照。己烷用作所有化学物质的溶剂和生物测定的对照。本实验中使用的二元和三元组合在表中给出。

2.6 统计分析

所有分析使用SAS 9.2进行，显著性水平为0.05。数据以平均值±标准误表示。使用卡方检验（χ2）分析寄生蜂在处理和对照之间的反应。未越过选择线的蜂被视为无选择并从分析中排除。使用GraphPad Prism v8.0生成图表。

3 结果

3.1 T. remus对Y型测定中粗提物的反应

未经历和经历过的T. remus都被OIPVs和SEVs吸引，而不是HPVs。具体而言，未经历过的T. remus对SEVs和OIPVs表现出显著吸引力，而与HPVs对照相比。此外，寄生蜂对HPVs的吸引力大于MEIPVs。经历过的寄生蜂也对SEVs和OIPVs表现出显著吸引力，而与HPVs对照相比。MEIPVs对经历过的寄生蜂没有显示出与HPVs的差异吸引力。

3.2 T. remus吸引中挥发性收集的时间

进一步评估了寄生蜂对不同时间点收集的挥发物的反应。未经历过的寄生蜂对产卵后36小时和60小时收集的OIPVs表现出显著吸引力，而与HPVs对照相比。然而，寄生蜂对产卵后84小时收集的OIPVs没有表现出偏好。经历过的寄生蜂也对产卵后36、60和84小时收集的OIPVs表现出显著吸引力，而与HPVs对照相比。

3.3 从健康植物、斜纹夜蛾卵和烟草OIPVs释放的挥发物的鉴定

气相色谱质谱（GC-MS）分析在健康植物和OIPVs的粗提物中分别鉴定出73种和84种化合物，从斜纹夜蛾卵中鉴定出34种化合物。由于MEIPVs在行为测试中未显示对T. remus的显著吸引力，因此不包括GC-MS结果。因此，从所有处理中鉴定的化学物质中选择了26种化学物质用于Y型嗅觉仪测定，基于文献中的信息、可用性和化学物质的生态相关性。所有测试的化学物质及其来源在表中指示。

在测试的26种化合物中，有11种影响了T. remus的行为反应。其中，六种化合物显示出统计上显著的吸引效果，而五种引起驱避反应。使用Y型嗅觉仪测试了T. remus对不同浓度的六种合成化合物的吸引力，如顺-3-己烯乙酸酯、芳樟醇、癸醛、（+）-α-蒎烯、二十四烷和二十三烷。11种化学物质对T. remus行为有影响。

3.4 寄生蜂对单一浓度合成化学物质的反应

选定的化学物质在10 ng/μL浓度下进行测试，以筛选有效的化学物质。化学物质顺-3-己烯乙酸酯显示出显著吸引力，具有显著的p值表明强统计显著性，芳樟醇、（+）-α-蒎烯、二十四烷、癸醛和二十三烷也显示出显著吸引力。某些化学物质显示出驱避效果，寄生蜂被对照吸引。寄生蜂对十五烷、癸烷、十六烷、十九烷和1-己醇表现出驱避反应。

3.5 寄生蜂对不同浓度有效化学物质的反应

寄生蜂在大多数六种化学物质的较低浓度1和10 ng/μL下表现出显著吸引力。顺-3-己烯乙酸酯在1和10 ng/μL浓度下显示出显著吸引力。在100 ng/μL浓度下未观察到显著吸引力，而在1000 ng/μL浓度下发生驱避。芳樟醇在1和10 ng/μL浓度下显示出较高吸引力。在100 ng/μL浓度下未观察到显著差异，然而在1000 ng/μL浓度下注意到驱避效果。（+）-α-蒎烯在1和10 ng/μL浓度下显示出显著吸引力。在100和1000 ng/μL浓度下未观察到显著吸引力。二十四烷在1和10 ng/μL浓度下显示出显著吸引力。结果表明在100 ng/μL浓度下没有显著吸引力。相比之下，寄生蜂在1000 ng/μL浓度下被对照（己烷）吸引。癸醛在10 ng/μL浓度下显示出显著吸引力。在1 ng/μL浓度下未观察到显著吸引力，但在100 ng/μL浓度下发生驱避。二十三烷在1和10 ng/μL浓度下显示出强吸引力。在100 ng/μL浓度下未观察到显著吸引力。

3.6 寄生蜂对有效化学物质的二元和三元组合的反应

每种化合物的最佳浓度被视为用于二元和三元组合。二元混合物显著吸引寄生蜂。顺-3-己烯乙酸酯+二十三烷（C + H）、二十三烷+（+）-α-蒎烯（H + P）、癸醛+顺-3-己烯乙酸酯（D + C）、顺-3-己烯乙酸酯+（+）-α-蒎烯（C + P）、顺-3-己烯乙酸酯+芳樟醇（C + L）、癸醛+二十四烷（H + T）、芳樟醇+二十四烷（L + T）、芳樟醇+（+）-α-蒎烯（L + P）都显示出显著吸引力。然而，P + T的混合物和顺-3-己烯乙酸酯+二十四烷（C + T）的混合物未显示显著吸引力。

L + D + C、L + P + O和L + P + T的组合未显示对寄生蜂的显著吸引力。然而，所有其他组合都吸引了寄生蜂。L + D + P、L + D + T、L + C + T、L + H + T、L + D + H、L + C + H、L + H + P都显示出显著吸引力。芳樟醇特别具有吸引力，无论是单独还是与其他化学物质组合，除了与L + C + P、L + P + T和L + D + C组合时。

4 讨论

卵寄生蜂利用草食动物活动响应释放的长程化学线索（HIPVs和OIPVs）以及来自宿主或其副产品的短程线索。优化这些合成挥发物的组成和浓度可以通过选择性吸引特定于目标害虫物种的天敌来增强生物控制策略。本研究证明未经历和经历过的T. remus都被产卵诱导挥发物（OIPVs）和斜纹夜蛾卵挥发物（SEVs）吸引，但不被来自手动引入卵的烟草植物挥发物（MEIPVs）吸引。这表明产卵特异性诱导物是植物释放信号以招募寄生蜂所必需的，或其他因素如产卵时间、宿主取食习惯和宿主丰度。

Y型嗅觉仪是广泛用于评估昆虫对挥发性有机化合物行为反应的生物测定。然而，几个限制可能影响其精确性和可靠性。诸如不平衡气流、气味通道污染和刺激源固定定位等因素如果未得到适当控制，可能导致不一致。此外，昆虫的生理状态，包括年龄、交配状态和先前暴露于气味源，可以显著影响其行为反应性。人工和简化的测试环境也不具有生态真实性，限制了对田间条件的推断。此外，使用小样本量可能削弱统计稳健性并导致有偏见的结论。在当前研究中，考虑了可能的限制，并采取措施最小化实验偏差。为最小化与小样本量相关的风险，每种化学物质用90个独立重复进行测试。通过定期交替嗅觉仪臂避免位置偏差，而两臂之间的气流速率和光分布持续监测并保持在恒定条件下。

在本研究中，未经历过的寄生蜂对产卵后36和60小时收集的OIPVs表现出显著吸引力，但对产卵后84小时的挥发物没有吸引力。这表明寄生蜂的反应取决于宿主产卵时间。我们的结果与先前报道的结果一致，即卵寄生蜂Trichogramma brassicae对产卵后24-36小时释放的挥发物最具吸引力。另一方面，经历过的寄生蜂对产卵后36、60和84小时释放的挥发物表现出积极反应。先前暴露于斜纹夜蛾卵不仅增加了T. remus对卵挥发物的吸引力，而且对OIPVs也增加了。在经历过的寄生蜂中观察到的增加吸引力可能表明联想学习，它们将先前的遭遇与某些化学物质联系起来。这种适应可以增强其适应性，降低搜索成本，并促进后续攻击的快速扩散。许多研究表明，卵寄生蜂进化出联想学习以在复杂和动态环境中搜索宿主。先前与宿主-植物相互作用的经验使寄生蜂能够更有效地响应宿主产卵诱导的信号。

我们的结果还证明，从斜纹夜蛾卵释放的挥发物（利它素）有效吸引T. remus。宿主昆虫产生独特的碳氢化合物、脂肪酸和蛋白质，增强附近捕食者和寄生蜂的搜索能力。这些化学物质对于宿主接受至关重要，并影响各种昆虫行为，包括取食、交配和产卵。寄生蜂的反应还取决于草食动物的取食习惯。例如，通用草食动物的专门寄生蜂可能更依赖草食动物的线索而不是植物的线索。与我们的结果相似，先前报道T. remus雌蜂被来自草地贪夜蛾卵的利它素吸引，在2-4天大的雌蜂中观察到最高吸引力。卵寄生蜂Trichogramma ostriniae天生被亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）卵块的挥发物吸引。此外，利它素已被证明增强稻赤眼蜂（Trissolcus japonicus）和幼虫外寄生蜂Holepyris sylvanidis的搜索效率和寄生率。

T. remus的吸引力因合成挥发性化合物的组合和浓度而异。在本研究中，从OIPVs、健康植物和斜纹夜蛾卵中鉴定出六种挥发性化合物（顺-3-己烯乙酸酯、芳樟醇、癸醛、（+）-α-蒎烯、二十三烷和二十四烷）。测试这些化学物质的不同组合显示，T. remus对合成化合物的二元和三元组合有显著吸引力，二元混合物比单一和三元化合物吸引更多寄生蜂。我们的结果与先前报道一致，即Apanteles carpatus更被壬醛和香叶基丙酮的混合物吸引。此外，顺-3-己烯乙酸酯和来自植物Hemizygia petiolata的精油以1:1比例的二元组合已被证明吸引寄生蜂Cotesia flavipes。三元化学组合也在Y型嗅觉仪中引起对T. remus的显著吸引力。然而，与二元组合相比，更少的寄生蜂被三元组合吸引，表明大多数昆虫嗅觉受体神经元仅对一种或非常有限数量的化学化合物响应。先前研究还证明，寄生蜂T. japonicus被合成化学物质乙基水杨酸酯、β-石竹烯和癸醛以1:1:1比例的组合吸引。粗提物中的某些化合物或两种以上化合物的组合可能具有驱避效果或掩盖其他化合物的吸引力。例如，未经历过的寄生蜂Microplitis rufiventris雌蜂避免含有吲哚的玉米HIPVs，但被不含吲哚的混合物吸引。类似地，另一项研究表明，异戊二烯可以通过干扰草本植物吸引天敌的能力来掩盖混合物中其他化学物质的效果。这些发现强调需要特定的化合物组合以实现最佳寄生蜂吸引力。

T. remus在大多数化学物质的1和10 ng/μL浓度下被强烈吸引，而100 ng/μL未显示显著吸引力，1000 ng/μL导致驱避。这表明寄生蜂高度发达的嗅觉系统能够检测复杂环境中的微小化学分数。昆虫行为受单一气味剂或几种组分混合物的特定浓度比例影响，每种组分由特定受体细胞检测。此外，较高剂量的挥发性化学物质可以驱避寄生蜂。我们的剂量敏感性发现与先前报道一致。与我们的发现相反，较高剂量的HIPVs成功吸引蚜虫寄生蜂Aphidius colemani。这种变化是预期的，因为寄生蜂经常表现出对 varying volatile concentrations的物种特异性反应。昆虫对挥发物表现出剂量依赖性反应，使得识别吸引和驱避化合物具有挑战性。混合物中化合物的比例及其在溶剂中的浓度是影响昆虫反应的关键因素。例如，茉莉酸诱导的挥发物因施用剂量和时间而异。合成VOC混合物的使用可以潜在地增强生物控制的有效性。通过为天敌提供一致和有针对性的线索，这些混合物可以优化寄生蜂的觅食行为并改善农业环境中的害虫管理结果。

5 结论

结果证实，斜纹夜蛾卵的挥发物和产卵诱导植物挥发物吸引Telenomus remus。寄生蜂的反应受到寄生蜂经验和宿主产卵时间的积极影响。此外，合成挥发性化合物的二元组合，特别是芳樟醇和二十四烷，比单一或三元混合物显著吸引更多寄生蜂。这些有吸引力的化合物可用于温室和田野的诱捕器中以保留寄生蜂。当前结果为开发针对斜纹夜蛾的环境友好和可持续害虫控制策略提供了宝贵见解。此外，结果揭示了推进Telenomus remus化学生态学研究的新机会，特别是在其与除广泛研究的草地贪夜蛾之外的其他鳞翅目害虫相互作用的背景下。然而，由于这些结果是在受控实验室条件下获得的，它们不足以得出关于田间效率的明确结论。因此，需要在自然田间条件下进一步验证以确认已识别化合物的行为相关性和实际适用性。此外，需要分子研究以识别参与行为活性信息化合物的生物合成和接收的特定基因。