前茬作物选择通过调控根腐线虫附着微生物群落抑制大麦根部穿刺短体线虫入侵的机制研究

本研究揭示了前茬作物种类通过调控土壤微生物组，影响穿刺短体线虫（Pratylenchus penetrans）体表附着细菌群落组成，进而抑制其入侵大麦根系的能力。玉米和埃塞俄比亚芥菜塑造的微生物组显著降低线虫侵染率，其关键菌属（如Chryseobacterium、Pseudomonas等）具有宿主特异性或保守性特征，为作物轮作和覆盖作物选择提供微生物定向调控新策略。

　　

摘要

土壤微生物组在植物-寄生线虫抑制中起关键作用，但植物-土壤相互作用的影响尚不明确。本研究以冬大麦为模型，探讨植物-土壤反馈对穿刺短体线虫（Pratylenchus penetrans）体表附着微生物组的影响，并验证线虫抑制的细菌驱动因素是否具有宿主保守性或特异性。通过将表面灭菌的线虫诱捕于不同土壤和根际微生物悬浮液中，分析其附着细菌群落发现：休耕和根际微生物组可减少线虫对大麦的入侵，且抑制强度因植物种类而异。仅玉米和埃塞俄比亚芥菜微生物组能显著抑制线虫入侵，而燕麦微生物组无此效果。线虫入侵抑制依赖于体表附着细菌，其中玉米微生物组富集变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。抑制性细菌在暴露于同种土壤的玉米和埃塞俄比亚芥菜根际微生物组中存在差异，关键属包括Chryseobacterium、Duganella、Streptomyces、Asticcacaulis、Pseudomonas及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员。结果表明，作物轮作和覆盖作物选择可定向调控线虫相关微生物组，从而预防根系入侵。

1 引言

植物-土壤反馈指植物与土壤组分间的动态相互作用，影响微生物性能、土壤性质和生态系统功能，形成对后续作物具正负影响的遗留效应。植物通过分泌根系分泌物塑造根际微生物群落，其成分因植物种类和基因型而异。根系分泌物、宿主植物遗传特性和根形态共同调控植物与微生物间的分子分泌与识别，从而影响根际微生物组组成。有趣的是，植物调控根际微生物组的能力存在差异：拟南芥和水稻的根际微生物组与休耕土壤相似，而玉米和百脉根则显著不同。

植物寄生线虫（PPNs）造成全球作物损失达12.6%，年经济损失约2160亿美元。线虫需在土壤中迁移至宿主根系，通过取食活根细胞质完成生命周期。其头尾部的化感器官（ amphids和phasmids）可检测根系分泌物或植物激素信号，触发线虫体表结构的快速变化。体表涂层主要由糖蛋白、脂质和碳水化合物组成，参与微生物附着过程。植物可感知线虫体表成分，而线虫体表涂层持续更新并在几分钟内响应宿主变化，可能减少被植物识别的概率。

线虫管理面临挑战：多数杀线虫剂已被禁用，抗性品种或非宿主作物常不可用或不盈利。以往研究聚焦于商用微生物接种剂（含单一或多种微生物），但其田间效果不稳定，主要因与土著微生物竞争而难以定殖。近年来，土壤微生物组成为调控植物免疫和抑制病原的关键因素，通过靶向关键微生物可调节土壤质量。例如，具有病害抑制特性的土壤可移植至其他土壤以增强抑病能力（如通过堆肥应用）。尽管已描述了对PPNs具抑制性的土壤并分析了其微生物组，但哪些微生物群落驱动线虫抑制以及如何通过作物多样化可靠建立它们仍不清楚。

本研究旨在探究不同植物种类调控的土壤微生物组对穿刺短体线虫（P. penetrans）入侵冬大麦的抑制影响，分析植物种类对土壤细菌群落组成的作用如何塑造线虫相关微生物组及其入侵宿主根系的能力，并鉴定抑制P. penetrans的特异性细菌物种。这些发现可为通过调控线虫相关微生物组控制植物寄生线虫提供创新策略，例如优化作物轮作和覆盖作物以工程化植物相关微生物群落，增强抑线虫能力和作物产量稳定性。

2 材料与方法

2.1 线虫附着微生物组对其入侵大麦根系的影响

为研究线虫附着微生物在抑制入侵中的作用，将表面灭菌的P. penetrans诱捕于玉米（Zea mays L. cv. Colisee）、埃塞俄比亚芥菜（Brassica carinata cv. Cappuccino）、燕麦（Avena strigosa cv. Luxuria）或休耕土壤的根际微生物悬浮液中，分析其附着细菌群落及入侵大麦根系的能力。土壤取自布伦瑞克沙壤土（pH 6.3，腐殖质1%）。休耕微生物组来自未种植盆钵，根际微生物组来自种植上述作物的盆钵，共进行2次独立试验，每处理24次重复。

大麦品种“Igri”种子表面灭菌后，在1%水琼脂上无菌萌发4天，将均匀幼苗转移至含0.8% Gelrite和1/2 MS盐的培养基中，每皿接种600条带原生微生物组或表面灭菌的线虫。培养3天后，根系用1%酸性品红染色，计数组织内线虫以量化入侵。

2.2 根际中线虫体表相关细菌群落

2.2.1 表面灭菌

线虫种群由比利时ILVO提供，在胡萝卜碟上繁殖2-3个月后，用Baermann漏斗提取。通过0.02% HgCl₂和200 mg L^?1硫酸链霉素处理，并经抗菌溶液（CellCultureGuard）孵育4小时实现表面灭菌。在R2A和PDA平板上验证无菌后，用于微生物接种。

2.2.2 微生物悬浮液中的线虫诱捕

表面灭菌线虫孵育于休耕土壤或不同植物根际的土壤悬浮液中。取5g土壤或根际样品与15mL无菌水在Stomacher中混合60秒，离心后取上清过5μm筛去除土著线虫。在5mL微生物悬浮液中孵育20,000条线虫过夜，收集线虫并洗涤去除松散附着微生物，用于DNA提取。

2.2.3 DNA提取与测序

使用FastDNA Spin Kit提取线虫附着微生物的总DNA，扩增16S rRNA基因V3–V4区（引物341F/806R），在Illumina HiSeq 2500平台上进行2×250 bp双端测序。

2.2.4 序列分析

使用FLASH合并双端序列，DADA2去噪和去嵌合体，通过QIIME 2流程和SILVA数据库v.138进行 taxonomic 注释，去除单例、污染物及非靶序列（叶绿体和线粒体）。

2.2.5 数据分析

通过单因素ANOVA和Tukey检验分析线虫入侵数量的差异；使用vegan、labDSV和mvabund包进行多变量分析；PERMANOVA基于Bray-Curtis相异矩阵；PCoA可视化群落差异；随机森林回归鉴定与抑制相关的ASVs，并通过Spearman相关分析验证。

3 结果

3.1 植物种类影响线虫微生物组附着与入侵

微生物组来源显著影响线虫入侵根系的数量（F=32.43, R²=0.55, p<0.0001）。与无附着微生物的线虫相比，诱捕于休耕或根际微生物组的线虫入侵率显著降低。燕麦根际微生物组与休耕土壤效果无显著差异（p=0.54），而玉米和埃塞俄比亚芥菜微生物组抑制效果最强。表明除遗传抗性外，根际微生物通过塑造线虫体表核心微生物组影响其入侵能力。

3.2 植物驱动的线虫体表微生物组变化

植物种类显著影响线虫体表细菌群落组成。根际与休耕土壤微生物组的比较解释了最大方差（R²=0.258, p<0.001），植物种类的影响类似（R²=0.237, p<0.001），而细菌群落对线虫抑制的贡献较低（R²=0.18, p<0.001）。PCoA显示玉米根际微生物组处理的线虫体表细菌群落与其他处理显著分离（PC1解释33.7%方差）。尽管玉米和埃塞俄比亚芥菜均具抑制性，但其细菌群落结构差异大：后者与非抑制性燕麦微生物组更相似。休耕土壤微生物组在PC1和PC2上均与根际处理不同。

线虫体表细菌物种丰富度在处理间差异显著（ANOVA, F=6.2, R²=0.6, p=0.009）。玉米微生物组处理的线虫体表物种丰富度最高，埃塞俄比亚芥菜与燕麦相似但高于休耕。Shannon多样性指数显示埃塞俄比亚芥菜和燕麦处理高于玉米和休耕。变形菌门为最丰富门类，玉米处理中变形菌门与厚壁菌门共存。

3.3 抑制性物种的宿主特异性与保守性

抑制性细菌物种既具宿主特异性，也在不同植物间共享。CCA分析表明，CCA1（76%方差）区分了抑制性细菌群落，富集于玉米和埃塞俄比亚芥菜根际；CCA2（24%方差）揭示特定抑制性ASVs与宿主植物特异性关联。这些ASVs主要属于α-、β-和γ-变形菌纲，以及放线菌纲、芽孢杆菌纲、黄杆菌纲和鞘氨醇杆菌纲。伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）和罗丹杆菌科（Rhodanobacteraceae）为常见抑制性家族。

关键抑制物种包括Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（ASV82, R²=0.6, p<0.002; ASV213, R²=0.74, p<0.001）、Pseudomonas（ASV108, R²=0.79, p<0.001; ASV246, R²=0.44, p<0.002）、Mucilaginibacter、Rhodanobacter和Dyella。玉米根际的所有抑制性ASVs均存在于埃塞俄比亚芥菜中，但后者有独特ASVs（如Chryseobacterium ASV75、Streptomyces ASV312、Duganella ASV120/171等）。土壤杆菌WF55（ASV241）和Bacillus（ASV113）为玉米特有。相关性分析显示细菌ASVs间存在强正相关（如Chryseobacterium、Duganella、Streptomyces等共存性与线虫根内数量负相关）。

4 讨论

植物-微生物组关联通过移植或富集过程支持植物功能性状。本研究中，线虫过滤的核心微生物组决定其入侵根系能力。根际微生物组在入侵前与线虫感染阶段接触，影响进入根系的线虫数量，表明除遗传抗性外，根际微生物通过塑造线虫体表核心微生物组起关键作用。土壤类型间微生物组抑制线虫的能力已有报道，但不同植物种类根际微生物组的影响罕有研究。

抑制效果与细菌群落组成显著相关。细菌多样性、物种丰富度与线虫抑制的关系因植物种类而异：玉米微生物组具最高物种丰富度，埃塞俄比亚芥菜兼具高丰富度与多样性。抑制性细菌物种既存在跨植物保守性（如Rahnella、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Pseudomonas等），也具宿主特异性（如玉米特异的Bacillus和土壤杆菌WF55，埃塞俄比亚芥菜特异的Chryseobacterium、Streptomyces等）。

先前研究从根结线虫卵块和二期幼虫中分离的Bacillus licheniformis和Pseudomonas fluorescens consortium可减少番茄根结形成。不同菌种通过多种机制抑制线虫：Burkholderia sp.可将线虫阻隔于根系外，分泌脂酶或HCN气体抑制线虫线粒体，或直接拮抗/诱导系统抗性。本研究表明前茬作物调控的土壤微生物组显著影响线虫入侵抑制，强调在农业实践中需综合考虑植物种类及其调控关键抑制菌株的能力。通过识别优势线虫种类并整合适宜作物于轮作体系，可有效降低线虫侵染。植物和土壤微生物通过不同机制协同抑制线虫，未来研究应聚焦微生物共存与相互作用的分子机制，以开发靶向、可持续的线虫管理策略。

5 结论

本研究揭示了植物-土壤微生物组相互作用在抑制穿刺短体线虫入侵大麦根系中的关键角色。特定植物种类调控的微生物群落组成与多样性决定根际抑线虫能力，玉米和埃塞俄比亚芥菜微生物组效果显著，且植物特异性细菌物种起核心作用。这些发现表明，在农业实践中整合植物种类选择与微生物群落管理可增强线虫抑制。除组装微生物群落外，优化作物轮作和前茬策略可定向调控植物相关微生物组以减少线虫损害。未来研究应探索微生物共存与相互作用的分子机制，发展靶向、可持续的线虫治理方法。