城市污染物壬基酚对海胆幼虫发育及转录组的差异性影响：亲本效应与核糖体基因应答机制

本研究揭示了城市相关污染物壬基酚（nonylphenol）对紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus）幼虫发育和基因表达的复杂影响。通过多浓度暴露实验，发现其效应在受精24小时后胚胎转录组激活时才显现，且存在显著亲本配对差异。最低浓度（100 ppb）反而导致存活率最大下降，转录组响应涉及核糖体基因通路，为理解EDC（Endocrine Disrupting Chemicals）的种内变异机制和海洋生态风险评估提供了关键分子证据。

　　

摘要

城市环境为研究新型应激源对生物性能的影响提供了独特机会。海洋潮间带处于海陆过渡区，暴露于废水排放、污水流出物和海岸线开发等一系列应激源中。尽管研究表明废水中的化合物（包括内分泌干扰物EDCs）会影响海洋生物的生存和发育，但其作用机制仍相对未知。本研究以紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus）为模型，探究了常见EDC壬基酚的发育和转录组响应。

1 引言

城市环境代表了一系列复杂的栖息地特征，常见的环境变化包括栖息地碎片化、温度、光照和噪音的增加，以及新型应激源（如污染物）的引入。近年来，越来越多的研究表明，城市环境对生物体具有强烈且可预测的影响。例如，欧洲黑鸟对处理的生理应激反应在城市种群中低于非城市种群，表明城市种群可能已经适应了应激环境。水污染会破坏剑尾鱼物种的生殖隔离，导致杂交增加。然而，绝大多数城市生态和进化研究涉及陆地系统，我们对城市海岸线上大量人为应激源如何影响海洋生物知之甚少。

海洋潮间带位于海陆交界处，潮间带生物面临复杂的城市应激源，包括雨水径流、污水废水和海岸线开发。一个特定的新型应激源来自家庭和工业产品中的化学物质，包括内分泌干扰物（EDCs），其在城市海岸线中的浓度较高。EDCs对一系列物种具有负面影响，包括海胆的发育异常和贻贝的发育异常。这些局部应激源可能影响生存、繁殖和扩散，最终产生种群水平效应。例如，烷基酚类影响龙虾的生存和蜕皮，并导致长岛海峡的大规模死亡事件。开发对城市海岸线化学物质如何影响早期发育阶段的机制性理解，对于理解污染对海洋种群长期存续的影响至关重要。

转录组数据可以更深入地理解应激响应的机制，尤其是与生存、发育和/或行为数据相结合时。例如，Balbi等人确定了暴露于双酚A的贻贝幼虫发育异常的差异表达模式。基因表达数据可以提供哪些基因在暴露于特定应激源后差异调节的见解，并允许比较不同发育阶段对应激的不同响应。在海胆Heliocidaris erythrogramma中，暴露于海洋酸化应激在不同发育阶段引发 distinct 基因表达响应，基因身份、响应幅度和响应方差在胚胎、幼虫和幼体阶段之间变化。然而，很少有研究将转录组和发育数据结合起来，以提供对海洋生物暴露途径的整体理解。

在本研究中，我们检测了不同浓度EDC暴露对紫色球海胆幼虫的影响。S. purpuratus是一种广泛分布的海洋无脊椎动物物种，范围从阿拉斯加到下加利福尼亚。它们是理解其他具有双相生命周期（浮游幼虫和底栖成体）的棘皮动物和海洋无脊椎动物的生理和发育途径的有价值模型。S. purpuratus是广播产卵者，每个雌性每次产卵产生数百万个卵，并且在实验室中很容易实现产卵。卵本身相对较大且透明，使得显微镜观察比其他海胆物种更容易。S. purpuratus幼虫的发育速率有良好记录，它们具有短世代时间，在几天内达到游泳和摄食幼虫阶段（长腕幼虫）。该物种是生态毒理学和进化生态学研究中常用的发育模型，先前的工作已经建立了可用于本研究的发育时间线和异常分类。

我们研究了三种浓度的城市水道中常见的EDC壬基酚的响应。壬基酚是烷基酚的一个亚类，占污水径流中烷基酚的80%。烷基酚具有高水溶性，用于各种工业和家庭产品，包括杀虫剂、除草剂、药物和塑料。EDCs actively 改变激素的功效，特别是甲状腺和类固醇激素。贻贝观察计划检查了87个潮间带地点各种EDCs的浓度，发现所有地点都有烷基酚的证据，其浓度随着城市化程度和径流接近度的增加而增加。我们结合了生存、发育和基因表达的测量，以理解壬基酚对早期发育阶段的影响。具体来说，我们问：（i）不同浓度的壬基酚如何影响生存、发育和基因表达；（ii）对壬基酚暴露的响应如何在不同发育阶段之间差异；（iii）哪些基因和生物通路对壬基酚暴露有响应。

2 方法

2.1 采集

我们从最初从Stillwater Cove（38.539677, -123.290377）采集的海胆种群中获得成体，并由水生资源组在加州大学戴维斯分校博德加海洋实验室维护。个体在流通海水系统中的共同花园环境中饲养数月，以模仿标准博德加湾温度（7月/8月水温约13.8°C），并随意投喂巨藻（Macrocystis pyrifera）以确保良好的生殖条件 before 产卵被诱导。我们从更大的实验室种群中收集了10个成体，以确保至少获得4个雄性和4个雌性用于完整实验。

2.2 产卵、受精和培养维护

为了诱导产卵，我们将2 mL的0.5 M KCl注射到围绕亚里士多德提灯（嘴）的围口膜组织中。如果个体是雌性，则将其放置在有过滤海水（FSW）的烧杯中，以便在底部收集卵子；如果个体是雄性，则将其口面朝上放置在小烧杯中以浓缩并保持精子 inactive until 受精进行。精子保持在冰上以增加寿命并在受精前减少精子运动力。一旦所有个体成功产卵，每组卵子在FSW中洗涤三次。在最终洗涤后，我们测量密度以确保每个烧杯大约为10-20个卵子/mL，以减少过度拥挤的风险。然后将雌性的一小部分卵子分成四个烧杯，代表研究中的对照和三个壬基酚暴露。烧杯然后完全填充其相应的处理水：（1）对照，（2）100 ppb壬基酚，（3）500 ppb壬基酚，和（4）1000 ppb壬基酚。

然后我们将浓缩精子添加到每个含有卵子的烧杯中，仅将一个雄性匹配到一个雌性，以建立四个单独的配对对或家庭，总共16个烧杯。我们在整个论文的其余部分将这些家庭称为配对对1-4。我们设置每个1000 mL烧杯带有一个搅拌桨，遵循Strathmann先前建立的方法，以保持幼虫均匀分布，维持水氧合，并确保最佳幼虫生长。在确认受精成功15分钟后，精子被洗出。我们使用Hodin等人详细描述的反向过滤方法清洁烧杯，并在实验第3天和第6天用适当的对照或壬基酚处理水重新填充它们。我们在15°C和FSW中35 ppm盐度下维持幼虫培养。

2.3 化学处理

壬基酚在污水径流中高度普遍，先前的研究表明，壬基酚导致极高比例的发育异常，暴露于100 μg/L（约壬基酚100 ppb）的牡蛎幼虫中有73%发育异常。在另一种海胆物种 painted urchin（Lytechinus pictus）中的初步实验发现，低于100 ppb的壬基酚浓度没有影响，因此我们选择仅测试100 ppb及更高浓度。鉴于先前的研究，我们为四个处理水平选择的处理是（1）对照，（2）100 ppb壬基酚，（3）500 ppb壬基酚，和（4）1000 ppb壬基酚。将二甲基亚砜（DMSO）以0.04 mL DMSO per 1 μL壬基酚的比例添加到我们的壬基酚浓度中，以确保壬基酚不粘附在玻璃器皿边缘，并且壬基酚的密度也被考虑（0.937 g/mL）。在先前的研究中未观察到DMSO alone的影响，因此我们未包括DMSO单独对照。最低浓度选择以 mirror Nice等人的论文，500和1000 ppb类似于Bj?rklund等人和Bressy等人的研究。用于溶液的海水是环境博德加湾海水（pH ~8.1），实验在博德加海洋实验室用于本地无脊椎动物实验的未加热房间进行（平均温度13.8°C）。暴露在未受精卵子和精子结合时开始，并通过每几天清洁和重新填充烧杯与存储在 carboy 中的标准化溶液保持恒定 throughout 研究。这确保了幼虫在受精期间和整个发育阶段暴露于壬基酚。完整的实验设计如图1所示。

2.4 受精和发育成功

我们使用Shore等人提出的相同方法量化受精和发育成功。为了量化受精成功，我们混合烧杯以确保卵子均匀采样，并从每个烧杯收集六个500 μL水样（总共16个烧杯，4个家庭×4个处理）。然后我们计算存在的受精和未受精卵子的数量。然后我们通过计算受精卵子数量 over 总卵子数量来评估平均受精比例。发育成功以类似方式计算：我们在受精后2小时（hpf）——当胚胎应该处于2细胞阶段时——从每个烧杯收集六个水样，并计算发育胚胎比例除以观察到的总胚胎以获得每个烧杯的平均发育成功。对于每个烧杯，我们平均六个重复样本的受精和发育比例。

2.5 幼虫生存评估

为了评估不同浓度的壬基酚如何影响生存，我们比较了两个发育阶段之间的培养密度变化：囊胚（17 hpf）和长腕幼虫（7 dpf）。我们每个烧杯采样10个重复样本，每个500 μL，并计算每个中存活个体的数量。然后，对于每个单独烧杯，我们平均囊胚阶段的10个重复中的胚胎数量，并对长腕幼虫阶段做同样处理。然后我们通过从囊胚平均数量中减去长腕幼虫平均数量，然后除以囊胚平均数量来计算阶段之间的生存。我们使用这个值来测试两个阶段之间的生存是否随着不同浓度的壬基酚处理在四个配对对之间变化。为了解释烧杯间密度变异，我们比较了这两个阶段之间的生存，而不是在单个时间点比较烧杯之间的密度。

2.6 幼虫形态学和发育异常

为了评估形态学和发育异常是否受到不同浓度壬基酚的影响，我们在三个发育阶段（囊胚、原肠胚（48 hpf）和长腕幼虫）从每个烧杯收集一个10 mL样本，并用0.1%戊二醛保存这些样本。这些保存的样本然后使用 raised coverslips 在尼康 Eclipse E600相位显微镜下以10倍放大成像。在收集所有16个烧杯的图像数据后，我们使用先前报告的S. purpuratus异常类型评估发育异常。这些异常类型包括 packed blastulae、胃降解的原肠胚、未发育的原肠胚，以及长腕幼虫阶段的多种异常，包括异常臂、降解胃、异常骨骼、发育停滞和钟形。在对每个发育阶段每个成像幼虫进行存在/缺席异常分类后，我们然后评估每个烧杯中异常幼虫的比例。

我们使用Fiji（GPLv3+, v. 2.16.0, built on top of ImageJ2）对保存的剩余正常幼虫进行阶段特异性测量。在所有三个阶段进行的测量更详细地显示在图S1中。对于囊胚阶段，取直径以评估整体胚胎大小（2A）。对于原肠胚阶段，测量高度（2B）和胃长度（2C）以评估发育进展。对于长腕幼虫阶段，我们收集了三个测量——体长（2D）、臂长（2E）和胃面积（2F）——这些测量在理解环境应激对长腕幼虫发育的影响时已被先前建立为有价值的形态学测量。

2.7 统计分析

所有统计在RStudio 4.3.1中进行。对于受精成功、发育成功、生存和异常比例的分析，我们使用线性模型拟合数据，包括配对对和处理作为固定效应。尽管我们打算将配对对作为生物重复，将其包括为随机效应，但很明显配对对之间的变异是一个有趣且重要的变异来源，我们应该估计，因此我们将配对对包括为固定效应。然而，我们在配对对-处理组合内没有多个烧杯，因此无法解释交互效应。然后我们使用ANOVAs来测试配对对和处理水平的显著性。

尽管我们使用ANOVA测试处理水平之间的整体差异，但对于生存，我们想明确询问每个处理是否低于对照，同时考虑配对对。我们通过从该配对对在对照处理中的生存中减去每个处理中的生存来计算每个壬基酚处理的相对生存值。然后我们使用单尾t检验来确定每个处理是否具有显著较低的生存。我们使用Bonferroni校正来解释多重测试。

对于形态学测量，我们将数据拟合到具有两个预测变量、配对对和处理的线性模型。在这种情况下，由于复制单位是单个幼虫（即，我们有 individual 测量），我们还包括一个交互项。使用ANOVA估计因素的显著性。所有均值和标准差信息使用dplyr包（v. 1.1.4）收集用于绘图。

2.8 转录组学

我们在原肠胚和长腕幼虫阶段收集样本用于转录组分析，以研究幼虫发育和基因表达模式如何受到处理和配对对的影响。从每个烧杯收集大约900个幼虫，以代表每个配对对、处理和阶段，并保存在Trizol中。尽管我们也尝试从囊胚样本中提取RNA，但我们无法从中提取足够数量的RNA，可能是因为囊胚尺寸小。按照Zymo Directzol Kit协议从每个合并样本中提取RNA。我们的一些烧杯生存率低（特别是那些属于配对对2的烧杯），并且我们没有足够的幼虫用于RNA-Seq。我们最终在两个阶段共有26个RNA样本：13个原肠胚RNA样本（缺失MP2对照，以及MP2 1000 ppb和MP3 500 ppb）和13个长腕幼虫RNA样本（缺失MP4 100 ppb，以及MP2 500 ppb和1000 ppb）。我们将总RNA发送到UC Davis基因组中心，在那里他们制备了3' Tag-Seq文库，每个实验烧杯单独条形码，然后所有样本使用Element Biosciences AVITI测序合并到一个测序通道中。每个样本的平均读数为8.6M，范围6.7M-11M，我们使用multiqc（v.1.23）可视化样本质量。修改并使用由J. Griffiths设计的RNASeq snakemake管道（https://github.com/JoannaGriffiths/RNASeq-snakemake-pipeline）运行FastQC v. 0.11.9（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）、FastP v. 0.23.4和Salmon v. 1.10.1 with default parameters。我们使用2019 Strongylocentrotus purpuratus参考基因组和来自NCBI RefSeq的参考转录组（GCF_000002235.5）（BioSample ID SAMN00829422, Baylor College of Medicine）。该管道执行 adapter 和质量修剪，并使用Salmon中的准映射方法生成一个矩阵，其中包含每个样本中每个转录本的估计丰度。进行预过滤步骤以去除在所有样本中计数小于或等于10的基因，以减少低丰度转录本。分别分析原肠胚和长腕幼虫样本，我们使用R包DESeq2（https://doi.org/10.18129/B9.bioc.DESeq2）数据通过参数拟合用于数据分散的方差稳定变换进行归一化，按文库大小归一化。

我们使用方差稳定变换值和前500个特征按方差进行主成分分析（PCA）。我们使用线性模型测试样本负载在PC轴上是否可以通过配对对或壬基酚处理解释 with lm(PC1 ~ Matepair + Treatment)。然后我们通过DeSeq2在每个发育阶段（原肠胚和长腕幼虫）内的数据使用似然比检验（LRT）来识别在不同处理水平之间变化的基因。对于每个基因，LRT比较一个包括配对对和处理的模型（表达 ~ 配对对 + 处理）与一个仅包括配对对的零模型（表达 ~ 配对对）。显著基因在考虑配对对效应后在不同处理之间变化。LRT是有用的，因为它允许我们同时比较所有处理，而不是在处理之间进行成对检验。最后，我们使用Ensembl bioMart数据库提取差异表达基因的注释和基因本体（GO）术语。我们使用topGO（v. 2.56.0）通过Fisher检验识别GO术语富集，使用所有表达基因作为背景。

3 结果

3.1 受精和发育

受精和发育成功在所有配对对和处理中 consistently 高。我们看到处理之间受精成功没有显著差异（双向ANOVA，F_3,3 = 1.065，p = 0.411）或跨配对对（双向ANOVA，F_3,3 = 1.835，p = 0.021）。发育成功看到类似模式，处理之间没有显著差异（双向ANOVA，F_3,3 = 1.644，p = 0.247）或跨配对对（双向ANOVA，F_3,3 = 2.333，p = 0.142）（图S2）。所有四个处理在所有烧杯中96.4%到100%的卵子受精（n = 16）。发育成功范围从90%到100% for all beakers except for the control beaker for mate pair 2, which had 75% development success。然而，由于这仅在一个配对对的对照中看到，这种发育成功的下降不是由于壬基酚处理。

3.2 幼虫生存

配对对具有不同的生存率（图2；双向ANOVA，F_3,3 = 4.004，p = 0.046）。幼虫密度每mL范围从囊胚阶段9到40，长腕幼虫阶段0到15。虽然整体生存不在处理之间变化（双向ANOVA，F_3,3 = 1.320，p = 0.327），但我们确实发现当测试每个壬基酚处理相对于对照的相对生存值时，100 ppb壬基酚处理中的生存略低，尽管在多重测试校正后显著性边际（单样本t检验，df = 3，Bonferroni校正p = 0.060）。

3.3 发育异常和形态学

跨所有配对对、处理和发育阶段组合，我们检查了每个烧杯20-106个囊胚（平均每个烧杯81）、每个烧杯27-86个原肠胚（平均每个烧杯61）和每个烧杯20-110个长腕幼虫（平均每个烧杯66）的异常。异常幼虫比例变化巨大，从0%到100%。异常比例在每个发育阶段内剧烈变化：囊胚6%到100%，原肠胚2%到96%，长腕幼虫0%到100%。发育异常在囊胚阶段跨配对对变化显著（双向ANOVA，F_3,3 = 48.240，p < 0.0001）。原肠胚阶段配对对之间发育异常存在边际显著差异（双向ANOVA，F_3,3 = 2.975，p = 0.089），但长腕幼虫阶段无显著差异（双向ANOVA，F_3,3 = 2.806，p = 0.101）。在所有三个阶段，未观察到壬基酚处理效应（双向ANOVA，囊胚：p = 0.351；原肠胚：p = 0.595；长腕幼虫：p = 0.121）。虽然我们无法统计测试配对对和处理之间的交互，但跨配对相对于处理似乎存在高度不一致的模式（图3）。配对对2显示从囊胚阶段开始并持续到原肠胚阶段的高异常比例。这在较高壬基酚处理中显得更高。然而，配对对2具有非常少的长腕幼虫异常，这与该家庭中非常低的生存配对，可能表明在最早发育阶段异常的个体没有存活到长腕幼虫。配对对4显示从原肠胚阶段开始的高异常比例，配对对3显示仅从长腕幼虫阶段开始的高异常比例。另一方面，配对对1在整个实验中显示低异常比例。

跨三个发育阶段的测量形态特征存在配对对、处理和交互效应，但处理效应跨配对对和阶段不一致（该数据的统计和可视化显示在图S3–S5中）。例如，在囊胚阶段，配对对4显示随着壬基酚浓度增加囊胚变小，而配对对3显示相反趋势，在较高壬基酚浓度下囊胚更大。进行的其他形态学测量具有类似不一致趋势，原肠胚高度和长腕幼虫体长在不同浓度之间变化，没有明显的共享响应我们的处理浓度。这些比较中壬基酚处理的显著性可能由每个烧杯测量的极大数量幼虫驱动（囊胚：平均=56胚胎，范围=0–93；原肠胚：平均=33胚胎，范围=1–73；长腕幼虫：平均=18幼虫，范围=0–56）。所有形态学测量的统计报告在表S1中。

3.4 基因表达

整体基因表达模式在两个发育阶段由配对对驱动，在原肠胚中额外按处理分离，但在长腕幼虫中不（图4）。我们获得每个合并幼虫样本平均8.6百万读长（范围6.69–10.95百万读长）。原肠胚样本的PCA显示配对对沿PC1（25%方差，双向ANOVA，F_3,3 = 15.882，p = 0.003）和PC2（14%方差，双向ANOVA，F_3,3 = 27.844，p < 0.001）分离。然而，PC2也分离不同处理，较低浓度落在较低PC2分数（双向ANOVA，F_3,3 = 15.997，p = 0.003）。PC4也由配对对驱动（图S6A，双向ANOVA，9%方差，F_3,3 = 28.625，p < 0.001），但该阶段的PC3和PC5–10都不显著。长腕幼虫基因表达模式主要由配对对驱动，这在PC1（34%方差，双向ANOVA，F_3,3 = 10.621，p = 0.008）和PC2（13%方差，双向ANOVA，F_3,3 = 11.487，p = 0.007）上都显著。对于长腕幼虫阶段，处理未显著驱动前两个PC轴上的模式。配对对在PC3（图S6B，双向ANOVA，9%方差，F_3,3 = 5.3823，p = 0.039）和PC4（双向ANOVA，7%方差，F_3,3 = 7.787，p = 0.017）上也显著，处理对PC4有轻微效应（双向ANOVA，7%方差，F_3,3 = 4.557，p = 0.054）。同时，该阶段的PC5–10不显著。

在原肠胚阶段，171个基因因处理而差异表达（似然比检验（LRT），p < 0.05）。在显示这171个基因及其标准化表达水平的热图中，我们看到与原肠胚阶段对照相比，所有壬基酚暴露处理条件中的上调，即使在配对对之间存在变异（图5A）。最 top 差异表达基因是10 kDa热休克蛋白。该基因的表达与处理正相关，对照中表达最低，1000 ppb处理中表达最高（图S7A）。其他显著差异表达基因是与核糖体蛋白、胚胎组蛋白、肝白血病因子和转录变体相关的基因（表S2）。在171个差异表达基因中，GO富集分析识别了81个过表征GO术语（p < 0.05）。这些GO术语与细胞器发育和代谢过程相关（表S3）。

对于长腕幼虫阶段，我们识别了57个基因在不同处理之间显著差异表达（LRT，p < 0.05）。这些基因的热图显示对照和1000 ppb之间的差异，但模式在处理上调和下调之间分裂（图5B）。最 top 差异表达基因是核糖体蛋白。该基因在1000 ppb处理中的表达远高于所有其他处理（图S7B）。其他显著差异表达基因与核糖体蛋白、微管相关基因、锌指蛋白和转录变体相关（表S4）。GO富集分析识别了34个过表征GO术语（p < 0.05）。这些GO术语与涉及微管过程和骨骼发育的基因相关（表S5）。两个阶段之间有七个共享差异表达基因。值得注意的是，所有共享基因都与核糖体蛋白表达相关（表1）。

4 讨论

居住在沿城市海岸线的海洋潮间带生物面临复杂的应激源混合物，包括来自雨水径流和污水废水污染物的化学物质以及海岸线开发、捕捞压力和其他应激源。理解陆地污染物如何影响海洋无脊椎动物的早期生命阶段对于理解污染对这些海洋城市环境种群的长期影响至关重要。在本研究中，我们检测了三种浓度的最常见城市相关烷基酚壬基酚对太平洋紫色海胆幼虫的影响。我们发现壬基酚对最早发育阶段没有影响，但我们开始看到生存、形态学和发育异常的不一致模式在配对对之间从囊胚阶段开始。基因表达数据表明核糖体通路在响应壬基酚处理中的作用。有趣的是，所有发育、形态学和转录组数据都受到配对对的强烈影响。结合，我们的工作表明EDCs可以对早期发育阶段产生强烈影响，但这种效应可能在不同交叉的幼虫之间变化，即使在同一种群内。

4.1 壬基酚发育效应在配对对之间的变异

在我们的生存数据中，我们观察到在最低壬基酚浓度下生存下降最强（单样本t检验，p = 0.060）。这在具有内分泌干扰化学物质的生态毒理学研究中并不罕见。这些化学物质通常表现出非 conforming 剂量响应曲线，或非单调响应，这意味着它们在较低浓度下可以比更高浓度产生更大影响。在暴露于塑料相关化学物质的S. purpuratus幼虫和暴露于壬基酚的另一种海胆物种Paracentrotus lividus中观察到类似现象。我们的研究和引用的例子都没有直接解决观察到的非单调响应背后的机制，需要更多工作来研究不同浓度的壬基酚和其他EDC暴露是否导致内分泌激素的变化以及发育和转录组效应。其他无脊椎动物，如线虫Caenorhabditis elegans，在最低壬基酚浓度下对生长的影响最大，表明低、生态相关浓度仍然可以对体型产生大影响。

壬基酚的效应在生活史和配对对之间变化。最早发育阶段显示没有壬基酚处理效应；受精和发育成功在所有处理浓度和家庭中 consistently 高。在太平洋紫色海胆幼虫暴露于塑料添加剂的另一项报告中类似发现高受精和早期发育。对此观察的一个可能解释是，在囊胚阶段之前（24 hpf），胚胎依赖母体转录本，但一旦它们到达囊胚阶段，它们开始表达自己的转录组。成人暴露甚至被显示影响EDCs对后代的影响，母体暴露导致发育胚胎 less sensitive。在我们的数据中，我们开始在处理在囊胚阶段看到效应，当胚胎开始表达自己的基因并快速发育仅在受精后24小时。囊胚阶段之后，