滑雪旅游对意大利中部阿尔卑斯山滑雪坡道雪地微生物组的塑造作用及其生态意义

本研究揭示了滑雪旅游对阿尔卑斯山雪地微生物组的显著影响，通过（16S rRNA）测序和显微镜技术发现，滑雪道内微生物和病毒载量更高，富含宿主相关类群（如Terrisporobacter、Enterococcus）和固氮微生物。人工造雪和人类活动引入了外来微生物和异生物质（如微塑料），改变了雪地微生态，可能影响高山生态系统的功能和健康，强调了系统性监测和保护雪地微生物组的必要性。

　　

引言

阿尔卑斯山是全球最受欢迎的滑雪目的地，滑雪旅游带来了巨大的经济收益，同时也对高山生态系统造成了显著的人为压力，威胁当地生物多样性并影响关键生态系统服务的提供。高山环境微生物组作为高山营养链的生命支持系统，正受到全球变化的威胁。雪地微生物组是一个高度动态的生态系统，其中耐冷和抗紫外线的微生物与来自温带淡水和土壤的异养广适性微生物共存。这一复杂微生物生态系统的建立主要涉及大气微生物的沉降、周围森林的叶际微生物组以及动物粪便污染的宿主相关微生物组。雪地中的嗜冷微生物参与碳和氮固定以及有机质分解等重要生物地球化学过程，在融化时与土壤微生物群落相遇，成为土壤微生物组的重要来源。冬季旅游和滑雪运动可能通过人工造雪、人类活动以及异生物质（如微塑料和滑雪蜡成分）的释放，塑造滑雪胜地雪地微生物组的组成布局。

材料与方法

站点描述、采样和环境数据

雪样在2021年12月至2022年4月的滑雪季节期间采集，采样点位于斯特尔维奥国家公园内的三个站点：圣卡特琳娜瓦尔富尔瓦滑雪道内（IN）、滑雪道外10米（OUT）以及坎卡诺湖附近的未受影响的参考站点（REF）。圣卡特琳娜瓦尔富尔瓦滑雪场位于海拔1738米至2880米之间，拥有约14条滑雪道，总长约35公里，2021-22冬季约有14.5万名滑雪者到访。采样点位于海拔2109米处，靠近滑雪缆车，暴露于北坡，坡度约20°，位于变质岩上，周围植被以干草甸和挪威云杉为主的针叶林为特征。滑雪道使用附近河流的水进行人工造雪。参考站点坎卡诺位于相似海拔（1936米），北坡，坡度小于10°，位于石灰质土壤上，周围植被以高山草甸和山松为主的针叶林为特征，冬季对车辆关闭，人员活动有限。所有站点都有公园主要脊椎动物物种（如马鹿、狍子、岩羚羊和野兔）的活动。采样时，三个站点的气象条件相似。表面雪（约前10厘米深度）使用预先灭菌的小铲子收集，用于微生物学分析的样品存储在-20°C直至运送。

用于测定微生物丰度的荧光显微镜技术

通过荧光显微镜测定雪样中的原核生物和病毒丰度。样品融化后，使用20微米网格过滤以排除其他颗粒（如微塑料、金属、灰尘）。每个过滤样品的三个重复用于原核和病毒丰度分析。添加DNA酶I（最终浓度2 U/mL）后孵育15分钟，然后过滤到0.02微米Anodisc滤膜上，用SYBR Gold I染色，在暗处孵育20分钟。染色后，滤膜安装在显微镜载玻片上，添加抗褪色溶液。使用荧光显微镜（1000倍放大）检查至少20个视野进行原核和病毒计数。使用方差分析（ANOVA）研究站点（REF、IN、OUT）和采样月份（1月、3月）之间的差异，显著性差异使用HSD-Tukey事后检验。

微生物DNA提取和16S rRNA扩增子测序

收集的雪在4°C融化后，通过真空过滤使用0.22微米孔径的MF-Millipore膜过滤器处理。使用DNeasy PowerWater Kit提取微生物DNA，通过NanoDrop ND-1000分光光度计定量。文库制备遵循Illumina 16S测序文库制备协议，使用携带Illumina过度衔接序列的314和785引物扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区。PCR条件为95°C 3分钟，随后30个循环的95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 30秒，最后72°C延伸5分钟。扩增产物使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化，使用Nextera技术制备索引文库并再次纯化。文库通过Qubit 3.0荧光计定量，归一化至4 nM并 pooled。最后，文库池用0.2 N NaOH变性，并用20% PhiX对照稀释至4.5 pM，在Illumina MiSeq平台上使用2×250 bp paired-end协议进行测序。

生物信息学和生物统计学

原始序列使用PANDAseq和QIIME 2流程处理，应用Usearch11的“fastq filter”功能保留高质量序列（预期错误每碱基E=0.03）。高质量序列使用DADA2聚类为扩增子序列变异（ASVs），通过识别和排除在阴性对照中检测到的ASVs去除潜在污染。基于alpha稀疏曲线分析进行归一化步骤，确保样品间的可比性。使用结合VSEARCH算法和q2-feature-classifier插件的混合方法进行 taxonomic 分配，训练于SILVA数据库（2020, v138.1）。丢弃所有分配给真核生物和未分配的序列。使用Shannon多样性、Simpson和Inverted Simpson指数、观察到的分类群数量和Faith系统发育多样性计算alpha多样性。使用加权和非加权UniFrac距离（ASV水平）和Bray-Curtis距离（不同分类水平）计算beta多样性。所有统计分析使用R软件进行，使用“vegan”包进行主坐标分析（PCoA）和置换检验（伪F比），使用Wilcoxon秩和检验评估alpha多样性差异，使用Benjamini-Hochberg方法校正p值。使用线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）识别站点间的判别分类群，保留LDA得分阈值±2（log₁₀尺度）和p≤0.05的分类群。使用BLASTn识别与LEfSe识别的判别属对应的细菌物种。使用PICRUSt2预测基于ASVs的宏基因组功能，输出文件用于构建热图表示判别ASVs的预测功能。ASVs在97%相似性下聚类以重建共享ASV网络，使用Cytoscape软件和Compound Spring Embedder（CoSE）布局生成图谱。

结果

受影响和未受影响站点雪样中的原核和病毒丰度

1月和3月在受影响站点（IN、OUT）和对照站点（REF）的原核和病毒丰度显示，1月IN和OUT站点的原核丰度无显著差异（平均5.19×10⁴ cells/mL），但高于REF站点（9.64±1.16×10³ cells/mL）。3月，IN站点的原核丰度最高（8.12±0.49×10⁴ cells/mL）。类似地，病毒丰度在IN站点 both 1月（2.79±0.23×10⁵ viruses/mL）和3月（4.38±0.21×10⁵ viruses/mL）均高于其他站点。最低值出现在REF站点（1月：7.77±0.46×10⁴ viruses/mL；3月：1.49±0.10×10⁵ viruses/mL）。所有原核和病毒丰度在3月均显著更高。

受影响和未受影响站点的雪地微生物生态学

使用16S rRNA基因NGS重建了2021年12月至2022年3月IN、OUT和REF站点雪地微生物组的结构和时间动态。从2021年12月至2022年3月每月采集雪样，共获得30,926条 reads from 24个样品（平均1288±1914）和618个ASVs。IN和OUT站点的雪地微生物组在门水平上整体多样性低于REF站点，尤其是根据Shannon和Simpson多样性指标。IN和OUT微生物组以Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidota为主，Actinobacteriota和Acidobacteriota为亚优势门，而REF微生物组在12月还显示了Halobacteriota的相关相对丰度。在较低分类水平（如科）上，IN和OUT微生物组比REF微生物组更多样。Faith系统发育多样性分析未显示站点间显著差异，表明观察到的群落差异可能主要源于主导组分分布的变化而非整体系统发育多样性。家庭水平组成结构显示，未加权UniFrac PCoA图在ASV水平上显示样品按时间点显著分离，表明雪地微生物组的变化主要受采样月份驱动。然而，基于Bray-Curtis的PCoA图在科水平上未发现分离，表明不同站点雪地微生物组的时间变化可能源于属于相同科的不同ASVs的重排。为进一步探索时间动态，构建了不同站点不同时间点共享ASVs的网络图。尽管绝大多数ASVs随时间 and between sites变化，10个ASVs在所有样品中共享，可能代表核心雪地微生物组组分。这些核心分类群占总雪地微生物组的48.2%±12.5%（相对丰度），包括已知的环境和植物根际相关细菌（如Sphingomonas、Pedobacter、Delftia、Stenotrophomonas）以及宿主相关分类群（如Escherichia–Shigella、Klebsiella、Enterococcus、Terrisporobacter）。其他宿主相关分类群（Muribaculaceae、Prevotellaceae、Clostridium sensu stricto 1和13以及Citrobacter）被识别为受影响站点的特征。宿主相关分类群的相对丰度随时间波动，并在站点间显示不同行为。

滑雪道上雪地微生物组的人为指纹

通过LEfSe分析识别区分不同站点的雪地微生物组特征。与REF站点相比，IN站点的雪地微生物组以属于Terrisporibacter、Clostridium sensu stricto 1、Acetobacteraceae、Citrobacter、Muribaculaceae和Methylobacterium–Methylorubrum的ASVs为特征。OUT站点以属于Stenotrophomonas、Terrisporobacter、Muribaculaceae、Clostridium sensu stricto 13和Prevotellaceae的ASVs区分。未发现任何ASVs特异性表征未受影响（REF）站点。直接比较IN和OUT站点时，IN站点特异性以属于Enterococcus的ASVs为特征。通过PICRUSt2推断IN和OUT判别ASVs的宏基因组，发现表征IN和OUT站点的ASVs具有涉及细菌感染过程和异生物质降解的功能，如苯甲酸酯、双酚、苯乙烯和己内酰胺，这些可能污染滑雪道。

讨论

本研究探讨了滑雪旅游对意大利阿尔卑斯山雪地微生物组的影响，重建了冬季旅游季节5个月期间三个站点（圣卡特琳娜瓦尔富尔瓦滑雪道内、外和坎卡诺湖附近低人为影响对照站点）雪地微生物群落的时间动态。通过荧光显微镜评估微生物丰度（原核生物和病毒），结果显示随时间增加的模式，3月在滑雪运动影响最大的站点（道内） both 原核生物和病毒丰度最高，表明滑雪季节结束时表面雪的微生物富集。使用NGS探索不同站点雪地微生物组结构随时间的变化，发现雪地微生物组组成结构的时间变异大于站点间变异，但主要涉及低分类等级的变化，源于相同科的ASVs重排。识别了一个核心雪地微生物组，由10个不同时间点和站点共享的ASVs组成，属于已知的冰冻圈微生物（如Sphingomonas、Pedobacter、Delftia、Stenotrophomonas）和宿主相关分类群（如Escherichia–Shigella、Klebsiella、Enterococcus、Terrisporobacter）。这些数据证实了雪地微生物组生态系统的复杂性，其中具有不同生态倾向的微生物共存，提供具有生态系统角色的功能，延伸远 beyond 高山冰冻圈。冬季旅游对雪地生态系统有显著影响，促进宿主相关和异生物质降解微生物的选择和富集。滑雪旅游引入了多个人为压力因子，重塑雪地微环境，包括广泛使用人工造雪（与自然雪相比具有 distinct 化学和微生物学特征，可能引入外来细菌和病毒）以及滑雪体育活动本身（导致从运动设备和滑雪蜡来源的各种异生物质化合物的释放，促进特定异生物质降解分类群的富集）。数据强调需要系统性监测冬季旅游对雪相关微生物群落的影响，这在过度旅游（如意大利阿尔卑斯山）和人工造雪日益 intensive 使用的背景下尤为紧迫。必须将监测努力扩展到所有高山生物群系，使用考虑雪地 microbiota 作为关键指标的集成方法，以评估对环境、动物和人类健康的系统影响，完全符合One Health框架。应采用可持续实践，包括用于高山滑雪的材料和造雪技术，以最小化冬季旅游对高山生态系统及其相关微生物组的环境影响。在生态系统已受损的情况下，应实施 targeted 环境恢复措施以恢复生态系统健康。