靶向仿生纳米颗粒负载α-香附酮通过激活Nrf2/HO-1通路和抑制ROS缓解LPS诱导的KGN细胞炎症反应

本研究开发了一种新型仿生纳米递送系统PLGA@AC@FSHL-M（PAMF）纳米颗粒，有效改善了α-香附酮（AC）的水溶性和靶向性。该系统通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路并抑制NF-κβ炎症通路，显著降低LPS诱导的KGN细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子表达，同时抑制ROS生成并改善线粒体功能，为卵巢储备功能减退（DOR）的治疗提供了创新性策略。

　　

1 引言

卵巢储备功能减退（DOR）是导致女性不孕的主要原因之一，其发病机制涉及遗传、医源性、免疫和环境等多因素作用。氧化应激（OS）、炎症和线粒体功能障碍被确认为生殖衰老的核心病理生理机制。颗粒细胞（GCs）作为卵泡中的关键支持细胞，其功能状态直接影响卵母细胞质量。研究表明，GCs中过度的活性氧（ROS）积累会导致线粒体功能障碍，破坏减数分裂纺锤体装置，最终引发DOR。

慢性炎症状态通过破坏GCs功能导致激素失衡和卵泡发育异常。炎症反应与氧化应激形成恶性循环，加速细胞损伤进程。α-香附酮（AC）作为传统中药香附的主要活性成分，虽具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多重药理活性，但其挥发性强、水溶性差、半衰期短等特性限制了临床应用。本研究通过纳米技术构建了具有GCs靶向功能的仿生纳米递送系统，为AC的临床应用提供了新思路。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

AC购自上海Master of Bioactive Molecules公司，PLGA（50:50，MW: 38,000–54,000）购自Sigma-Aldrich。FSHL81-95肽段（序列：QCHCGKCDSDSTDCT）由上海强耀生物合成。细胞实验采用人源KGN颗粒细胞系，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

2.2 纳米颗粒制备与表征

采用纳米沉淀法制备PLGA封装AC的纳米颗粒（PA NPs），并通过 macrophage 膜 camouflage 和 FSHL81-95肽段修饰构建PAMF NPs。透射电镜显示NPs呈球形，粒径约98 nm，zeta电位-22.4 mV。AC封装效率达89.4%，在pH 5.4条件下48小时累积释放率达45.7%，显著高于pH 7.4条件的19.2%。

2.3 细胞实验方法

通过MTT法检测细胞活力，流式细胞术分析凋亡率，DCFH-DA探针检测ROS水平，MitoTracker Red评估线粒体功能。qRT-PCR和ELISA分别检测炎症因子mRNA和蛋白表达，Western blot分析Nrf2、HO-1和NF-κβ蛋白表达，免疫荧光观察Nrf2核转位。

3 结果

3.1 AC对LPS诱导的KGN细胞炎症的影响

MTT实验表明AC在20-120 μM浓度范围内显著促进KGN细胞增殖，最佳浓度为80 μM。LPS处理显著降低细胞活力，而AC处理组（特别是PA、PAM和PAMF NPs）能剂量依赖性地逆转这种效应。

3.2 仿生纳米颗粒的合成与鉴定

FSHR在颗粒细胞表面特异性表达，FSHL81-95肽段修饰显著增强NPs的细胞摄取效率。预处理FSHL81-95肽段可使PAMF NPs的内化效率降低约8倍，证实其靶向作用机制。pH响应释放实验显示，在酸性环境（pH 5.4）中AC释放率显著提高，符合肿瘤微环境特性。

3.3 PAMF NPs对细胞增殖和抗凋亡的作用

流式细胞术显示LPS处理使KGN细胞凋亡率升至24.24%，而PAMF NPs处理组降至8.98%。MTT结果表明PAMF NPs能显著恢复LPS抑制的细胞增殖能力，效果优于单纯AC和未靶向NPs。

3.4 PAMF NPs对炎症抑制的作用

qRT-PCR和ELISA检测显示LPS显著提升TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，而PAMF NPs处理组这些炎症因子的mRNA和蛋白表达均显著降低。Western blot进一步证实PAMF NPs对炎症蛋白表达的抑制作用最为显著。

3.5 PAMF NPs对ROS产生的调控

DCFH-DA荧光检测显示LPS处理组ROS水平最高，AC处理组（尤其是PAMF NPs）能显著降低ROS生成。这表明AC通过其抗氧化特性缓解了LPS诱导的氧化应激。

3.6 PAMF NPs对线粒体功能的改善

MitoTracker Red染色显示LPS处理导致线粒体功能严重受损，而PAMF NPs处理能显著恢复线粒体活性，表明AC具有保护线粒体功能的作用。

3.7 Nrf2/HO-1通路激活与NF-κβ抑制机制

免疫荧光显示PAMF NPs促进Nrf2核转位，Western blot证实其上调HO-1表达同时抑制NF-κβ活化。这表明PAMF NPs通过激活抗氧化通路Nrf2/HO-1和抑制炎症通路NF-κβ发挥协同保护作用。

4 讨论

本研究首次证实AC负载的仿生纳米颗粒对LPS诱导的KGN细胞炎症模型具有显著保护作用。FSHL81-95肽段修饰实现了对颗粒细胞的特异性靶向，macrophage膜 camouflage 延长了体内循环时间。机制研究表明AC通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路和抑制NF-κβ炎症通路，降低炎症因子表达和ROS水平，改善线粒体功能，最终促进细胞增殖和抑制凋亡。

然而研究存在一定局限性：首先仅聚焦于Nrf2/HO-1经典通路，其他潜在信号通路需进一步探索；其次目前仅为体外细胞实验，需要动物模型验证体内疗效；最后需深入研究AC对卵母细胞的直接作用。尽管如此，本研究为DOR的治疗提供了新型纳米靶向策略，具有重要的转化医学价值。

5 结论

AC负载的仿生纳米颗粒PAMF通过特异性靶向颗粒细胞，有效缓解LPS诱导的炎症反应和氧化应激。其作用机制涉及激活Nrf2/HO-1抗氧化通路和抑制NF-κβ炎症通路，显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子表达，改善线粒体功能，促进细胞增殖。本研究为卵巢储备功能减退的靶向治疗提供了创新性纳米平台。