靶向CD19 CAR-T细胞中MND启动子的优化策略增强抗肿瘤杀伤效能并维持T细胞干性

本研究系统比较了MND、MSCV、EF-1α和CMV四种启动子在CD19 CAR-T治疗中的表现，发现MND启动子具有更优的病毒包装效率、转导效率和抗白血病活性，同时能维持较高比例的初始T细胞（Tn）亚群，为优化CAR-T细胞治疗提供了重要理论依据。

　　

引言

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法作为肿瘤免疫治疗的重要突破，通过基因工程技术使T细胞特异性识别肿瘤相关抗原，显著增强抗肿瘤效果。尽管CD19 CAR-T在复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（R/R B-ALL）中取得70%-90%的完全缓解率，但仍面临毒性反应和疾病复发的挑战。启动子作为调控CAR分子表达的关键元件，其选择直接影响CAR-T细胞的功能特性和治疗安全性。

材料与方法

研究构建了四种不同启动子（MND、MSCV、EF-1α和CMV）驱动的CD19 CAR慢病毒载体，采用PEI法转染HEK293T细胞生产病毒。通过ELISA检测p24病毒滴度，流式细胞术分析转导效率和CAR表达水平。从健康供者外周血分离PBMC，经CD3/CD28磁珠激活后以MOI=5进行转导。体外杀伤实验采用Nalm6-GFP-Luc细胞系，通过生物发光法评估细胞毒性。小鼠模型使用NSG小鼠接种2×10⁶肿瘤细胞后输注5×10⁶ CAR-T细胞，通过活体成像监测肿瘤负荷。采用RNA-seq进行转录组分析，筛选标准为Fold Change≥2且FDR<0.01。

结果

病毒包装与转导特性

MND启动子显示出最高的病毒包装效率，其病毒滴度显著高于其他启动子。在MOI=5条件下，MND驱动的CAR-T细胞转导效率达峰值，显著高于CMV和MSCV组。虽然EF-1α组转导效率与MND无统计学差异，但MND组在72小时内呈现更稳定的转导动力学特征。值得注意的是，MND组的平均荧光强度（MFI）显示其CAR表面表达水平适中，提示该启动子可能避免CAR的过度表达。

细胞亚群与耗竭标志物

四种启动子驱动的CAR-T细胞在增殖能力、CD4/CD8比例和耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）表达方面无显著差异。然而在CAR阳性细胞中，MND组显示出更高的初始T细胞（CD45RA⁺CD62L⁺）比例，而MSCV组效应T细胞（CD45RA⁺CD62L^-）比例升高。这种表型特征提示MND启动子可能有利于维持T细胞的干性和长效持久性。

体外杀伤功能

在1:3、1:1和3:1的效靶比下，MND CAR-T细胞均展现出最强的肿瘤杀伤能力，尤其对CD19低表达的U2932细胞仍保持较高细胞毒性。值得注意的是，在肿瘤再刺激实验中，MND组表现出持续的抗肿瘤能力。细胞因子检测显示MND组分泌TNF-α、IFN-γ和IL-6水平适中，提示其在保持高效杀伤的同时可能降低细胞因子释放综合征（CRS）风险。

体内抗肿瘤效应

小鼠模型显示MND CAR-T治疗组生存期显著延长，至观察终点（45天）仍全部存活，而对照组小鼠在23-24天全部死亡。活体成像显示MND组肿瘤增殖受到明显抑制。流式检测发现MND组在体内扩增峰值最高，且Tn细胞比例与CAR阳性细胞数呈正相关（spearman r=0.7413, p=0.0078），证实初始T细胞亚群与体内持久性密切相关。

转录组学特征

PCA分析显示四组CAR-T细胞转录谱明显分离。MND与MSCV组差异表达基因达3694个，其中1997个基因上调。GO分析显示这些基因富集于T细胞活化、DNA复制、转录活性和细胞周期等生物学过程。KEGG分析提示MND组在JAK-STAT信号通路、抗原加工提呈、T细胞受体信号通路等方面显著激活。这些结果表明MND启动子驱动下的CAR-T细胞处于高度活化状态，但通过特定调控机制维持细胞功能平衡。

讨论

本研究首次系统比较了四种临床相关启动子在CD19 CAR-T治疗中的综合性能。MND启动子展现出独特的优势：其较高的病毒包装效率可提高生产效益，适中的CAR表达水平可能避免T细胞耗竭，而维持初始T细胞亚群的能力则有助于延长体内持久性。转录组分析进一步揭示MND可能通过调控记忆相关基因影响TCR信号通路，从而调节T细胞分化进程。这些发现为CAR-T细胞的启动子选择提供了重要依据，对优化临床治疗方案具有指导意义。