综述：肿瘤单细胞生物信息学：从免疫图谱到分子动力学

本综述系统总结了单细胞RNA测序（scRNA-seq）在解析肿瘤微环境（TME）中的最新进展，重点探讨了其在免疫细胞图谱构建、新型细胞亚群发现、细胞动态轨迹推断、细胞互作网络分析以及临床精准治疗策略开发中的应用，为肿瘤免疫治疗耐药性和个体化 oncology 提供了前沿见解和未来方向。

摘要

单细胞RNA测序（scRNA-seq）彻底改变了我们对肿瘤的理解，使我们能够以高分辨率解析肿瘤的细胞组成。传统上被视为均质癌症细胞团的肿瘤，现在被认识到是由肿瘤微环境（TME）塑造的复杂生态系统，其中包括多种免疫细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和细胞外基质成分。scRNA-seq揭示了TME内的显著异质性，识别了新的或罕见的免疫细胞亚群，并描绘了它们的动态功能状态。特别是，它阐明了驱动肿瘤进展和免疫逃逸的细胞间信号网络和时间细胞状态转换。此外，将scRNA-seq数据与临床信息整合，突显了其在改善患者分层、生物标志物发现和治疗靶点识别方面的潜力。

1 引言

癌症仍然是全球死亡率的主要原因之一，对提高人类预期寿命构成了持续挑战。尽管近年来医学取得了进展和突破，但全球癌症负担仍在增长，并预计在未来50年内继续增长。过去几十年，我们对癌症的理解经历了重大转变。曾经被视为相对同质的癌症细胞团的肿瘤，现在被认识到是称为TME的复杂生态系统。这个复杂的 milieu 包括多种成分，如肿瘤浸润免疫细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和细胞外基质。

近年来，大量的研究工作致力于描绘TME在癌症进展中的作用。越来越多的证据表明，TME通过多种机制促进癌症侵袭和转移，如血管生成、细胞外基质重塑和免疫抑制，这些现在被认为是癌症的标志。研究TME的一个主要挑战是肿瘤异质性，包括瘤内和瘤间异质性。肿瘤异质性不仅在表型水平上观察到，而且在遗传水平上也是如此，进一步强调了剖析TME的复杂性。在TME的各种成分中，免疫细胞扮演着特别重要的角色，表现出促瘤和抗瘤效应。不同免疫细胞群的浸润与癌症进展相关，表明肿瘤浸润免疫细胞可以作为有价值的预后生物标志物和治疗靶点。因此，TME的免疫景观已成为研究的关键焦点。

传统的生物技术提供了整体肿瘤样本的视图，不足以分析肿瘤内的特定细胞类型。然而，下一代测序的进展彻底改变了我们解释复杂TME的方法。scRNA-seq已成为一种最先进的技术，使研究人员能够以单细胞分辨率研究TME。它是一种强大的基因组技术，允许研究人员分析单个细胞的基因表达谱，促进生成TME的详细细胞图谱。由于每个细胞在时间和空间上都是独特的，scRNA-seq提供了对细胞异质性的关键见解。

这些可以通过推断肿瘤中的细胞-细胞相互作用和细胞轨迹来实现，借助不断出现的scRNA-seq分析工具。此外，从scRNA-seq研究中获得的关于TME的信息具有宝贵的临床意义，包括新疗法的开发、生物标志物的识别和改进的患者分层。本综述旨在探讨scRNA-seq在揭示TME内部结构中的多样化应用，借鉴相关研究来说明其在推进我们对TME理解方面的潜力。

2 TME中免疫细胞图谱的建立

TME是一个复杂且异质的生态系统，包含各种在癌症进展中起关键作用的免疫细胞类型。多项研究利用scRNA-seq剖析TME，提供了肿瘤内细胞景观的详细视图，包括免疫成分，建立了全面的免疫细胞图谱。

建立免疫细胞图谱的一个显著发现是，在不同癌症类型中观察到的免疫细胞种群组成不同。例如，Chung等人的一项早期研究对11名乳腺癌患者的515个细胞进行了scRNA-seq，识别了三个主要的免疫细胞群：B细胞、T细胞和巨噬细胞。Azizi等人的另一项重要里程碑研究通过对8名乳腺癌患者的45,000个免疫细胞进行scRNA-seq，生成了更全面的免疫细胞图谱。值得注意的是，该研究揭示了T细胞的异质性以及激活和分化状态的连续性。

另一种癌症类型——肺癌的全面免疫细胞图谱也由Lambrechts等人于2018年通过对肺癌患者的52,698个细胞进行scRNA-seq建立。作者生成了包括免疫成分在内的TME全面单细胞图谱。在不同的免疫成分中，B细胞被观察到是最富集的。免疫细胞分析还揭示了不同的免疫亚群及其特征，例如，CD8⁺ T细胞标记基因的低表达与肺腺癌（LUAD）的改善生存相关，但与肺鳞状细胞癌（LUSC）的较差生存相关。一项更近期和全面的对42个晚期NSCLC活检样本的scRNA-seq研究通过细胞间信号网络表征了TME的各种成分及其相互作用。一些罕见的免疫细胞亚型在肿瘤中被识别，如滤泡树突状细胞和T辅助17（Th17）细胞。

黑色素瘤的免疫细胞图谱早在2016年就已由Tirosh等人通过对19名患者的样本进行scRNA-seq生成。对TME各种成分的详细表征揭示了它们通过细胞间信号网络的潜在相互作用。对肿瘤浸润T细胞的分析揭示了衰竭程序，它们与T细胞激活和克隆扩张的联系，以及它们在患者间的变异性。T细胞在癌症进展和免疫疗法效果中的关键作用已在各种癌症研究中强调，强调需要除了免疫细胞图谱之外的详细T细胞图谱。例如，Li等人进行了一项研究，使用从25名黑色素瘤患者样本中分离的T细胞和NK细胞进行更深入的T细胞分析。他们的结果与之前的scRNA-seq研究一致，显示了一个从早期功能障碍到高度功能障碍T细胞的分化谱，而不是离散的T细胞种群。这种广泛观察到的现象表明，这是T细胞的普遍特征，而不是患者特异性的。作者还观察到，功能障碍特征在来自肿瘤的CD8⁺ T细胞中比在外周血中更突出，表明这种功能障碍状态是在TME内局部诱导的。

除了上述研究外，许多研究人员在表征各种癌症类型的TME方面做出了重大努力，如头颈鳞状细胞癌（HNSCC）、肝细胞癌（HCC）、结直肠癌（CRC）、胰腺导管腺癌（PDAC）和骨肉瘤。所有这些研究都利用scRNA-seq剖析TME，通过揭示每种癌症类型的独特免疫景观，识别了免疫细胞的不同亚群或功能状态。这些贡献显著增强了我们对肿瘤生物学的理解，并具有重要的治疗意义。

基于不同癌症类型TME中免疫景观的高分辨率图谱，详细的图谱已成为scRNA-seq泛癌分析的有价值参考点，使得能够识别不同癌症间的共享和独特特征。这些泛癌分析在它们的特定焦点领域上有所不同，如免疫细胞亚集、癌细胞分类和整个细胞生态系统。例如，Gavish等人整合了来自77项scRNA-seq研究的数据，分析了跨越24种癌症类型的1163个肿瘤样本，以提供转录瘤内异质性（ITH）的广泛视图。尽管这项研究专注于检查恶性细胞的ITH，但它提供了一个大规模的免疫细胞图谱，显示巨噬细胞、T细胞和B细胞与其他免疫成分相比 heavily infiltrated。他们还研究了T细胞的细胞毒性和招募；例如，他们观察到CD8⁺ T细胞细胞毒性与巨噬细胞干扰素反应之间的强相关性。Kang等人最近对来自跨越30种癌症类型的1000多个肿瘤的scRNA-seq数据集进行了大规模分析，包括匹配的正常组织。这项研究更强调TME；一个主要发现是三级淋巴结构的基因特征和免疫成分的识别，这些是淋巴细胞的异位聚集，先前与有利的免疫治疗反应相关。他们还识别了几种与免疫治疗反应差相关的细胞状态；例如，CTSK⁺巨噬细胞。通过揭示共享和癌症特异性特征，或处理和未处理特征，大规模泛癌分析为未来精准肿瘤学的发展提供了宝贵信息。

除了提到的泛癌分析外，TME的重要性通过进行特定免疫细胞类型的scRNA-seq泛癌分析的努力得到进一步强调和展示，如NK细胞、髓系细胞和T细胞。Tang等人整合了来自跨越24种癌症类型的700多名患者的scRNA-seq数据，生成了一个全面的肿瘤浸润NK细胞图谱。作者以癌症类型特异性方式检查了NK细胞异质性；例如，未成熟的CD56^brightCD16^lo NK细胞被观察到在鼻咽癌（NPC）和基底细胞癌中富集。此外，一些普遍特征被报道，如大多数癌症类型中CD56^dimCD16^hi NK细胞水平降低，以及具有受损细胞毒性的功能障碍状态，命名为TaNK细胞。另一项更近期的泛癌NK细胞研究也识别了CD56^bright和CD56^dim NK细胞作为TME中的主要亚型，CD56^bright NK细胞较不成熟，CD56^dim NK细胞更具细胞毒性。这些亚集被发现代表沿着分化连续体的不同状态，从CD56^bright过渡到CD56^dim NK细胞。进一步亚分类揭示了几个功能不同的亚型，如DNAJB1⁺CD56^dimCD16^hi NK细胞、应激CD56^bright NK细胞、效应CD56^dim NK细胞和适应性CD56^dim NK细胞。

其他免疫细胞类型的泛癌研究，如中性粒细胞，也揭示了它们的异质性。Wu等人整合了来自跨越17种癌症类型的143名患者的scRNA-seq数据来分析中性粒细胞，并识别了10种具有特殊功能的不同状态，包括血管生成、趋化性和抗原呈递。值得注意的是，一个关键发现是HLA-DR⁺CD74⁺中性粒细胞作为潜在免疫治疗通过抗原呈递刺激T细胞的识别，在免疫抑制性TME中提供了替代抗原呈递策略，其中经典APC细胞，如具有HLA下调的DC，是功能障碍的。中性粒细胞的表型和功能异质性也在另一项整合人和小鼠scRNA-seq数据集的研究中进行了检查，而只研究了少数癌症类型。识别了两种主要亚型：一种激活亚型类似于健康中性粒细胞，和一种肿瘤特异性亚型。这项研究还暗示IL1β/CXCL8/CXCR2信号轴作为中性粒细胞从健康状态向肿瘤促进和转移状态转变的驱动因素。

B细胞同样在2024年成为广泛泛癌分析的主题。Ma等人使用scRNA-seq分析了从跨越20种癌症类型的269名患者获得的B细胞数据，辅以单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）和单细胞B细胞受体测序，以生成肿瘤内B细胞的多组学图谱。识别了15个B细胞亚集，遵循生发中心（GC）或生发外（EF）发育途径。其中四个亚集是先前未表征的：干扰素刺激基因阳性 na?ve B细胞、具有热休克蛋白和缺氧相关基因表达升高的应激B细胞、前GC B细胞和具有高DUSP4表达的非典型记忆（AtM）B细胞。重要的是，EF和GC B细胞反应之间的平衡与疾病进展和临床结果相关。例如，来自EF途径的AtM B细胞与免疫抑制活动和不良预后相关。不久之后，另一项研究分析了来自跨越19种癌症类型的649名患者的B细胞。这项研究也报道了在Ma等人研究中观察到的DUSP4⁺ AtM B细胞的存在，而他们报道DUSP4⁺ AtM B细胞为两个亚群：FCRL4⁺非典型B细胞（ABCs）和PDCD⁺ ABCs。他们强调了识别应激反应记忆B细胞和ABCs的重要性，尤其是FCRL4⁺ ABCs，这些被表征为高度增殖性，具有显著的克隆扩张，并观察到与CXCL13⁺CD4⁺ T细胞相互作用，为预测免疫治疗反应提供了潜在生物标志物。Fitzsimons等人通过表征表型不同的B细胞亚型进一步证实和 refined 了这一泛癌肖像。与Ma等人一致，这项研究也报道了具有高DUSP4表达的AtM B细胞的存在，以及一组在Ma等人研究中观察到的三个激活B细胞集群中的激活B细胞。一起，这些泛癌B细胞研究提供了全面的图谱，作为理解肿瘤内B细胞多样性和功能的有价值参考。

类似地，Cheng等人使用来自跨越15种癌症类型的210名患者的髓系细胞创建了一个大规模肿瘤浸润髓系细胞图谱，展示了肿瘤浸润髓系细胞的高度异质性，并揭示了它们的共享和癌症特异性特征。例如，LAMP3⁺常规DC（cDCs）被观察到广泛存在于不同类型的癌症中，并且在NPC中发现TNF⁺肥大细胞的 greater abundance。他们还观察到不同癌症类型中不同的巨噬细胞亚集，如SPP1⁺ TAMs、C1QC⁺ TAMs和FN1⁺ TAMs，这些在不同癌症类型中富集。另一免疫成分T细胞的泛癌分析由Zheng等人使用来自具有21种癌症类型的316名患者的T细胞的scRNA-seq数据 performed，旨在为肿瘤相关T细胞的全局推断构建高分辨率泛癌T细胞图谱。作者识别了各种T细胞亚群和功能状态，以及与这些种群或状态相关的潜在生物标志物或基因特征；例如，FAT1突变与TNFRSFP⁺ T调节细胞（Tregs）正相关。这些发现可能 suggest 开发或改进基于T细胞的免疫疗法的潜在途径。

所有这些scRNA-seq研究生成了关于TME的大量复杂数据。一个典型的scRNA-seq工作流程如图2所示，概述了生成和分析单细胞转录组数据的关键步骤。为了处理这些 vast and intricate 数据，研究人员做出了重大努力来策划和组织可用的scRNA-seq数据集，生成公共数字平台，这些平台包含了用于其分析和可视化的先进工具。这些研究中使用的主流协议，包括它们的方法学和技术方法，总结在表1中。一个这样的 pioneering 努力是Cheng等人开发的交互式基于网络的工具，提供了从泛癌髓系细胞分析生成的髓系图谱的访问。类似地，肿瘤免疫单细胞中心（TISCH）已成为一个大规模平台，包含来自27种癌症类型的76个数据集，提供了一个用户友好的界面来访问关于全局TME的信息，例如，细胞类型、基因表达和患者信息。更近期，另一个类似平台ImmcanSCDB也被开发用于以癌症类型特异性或普遍方式探索TME。研究人员收集了来自56种癌症类型的144个数据集的数据，并用精确的临床、技术和生物信息注释了数据，提供了一个自由访问 yet 全面的平台。随着不同癌症类型的scRNA-seq分析变得更加成熟，这种大规模数据库的开发变得更加常见；其他例子包括CancerSEA、癌症单细胞表达图谱（CancerSCEM）、表征肿瘤亚群（CHARTS）和CanCellVar。所有这些研究旨在整合可用数据集以开发大规模平台，允许以更易访问的方式检查免疫细胞图谱。

3 TME中新型和罕见免疫细胞类型的发现

成功建立各种癌症类型全面细胞图谱的一个主要含义是新型免疫细胞亚集或状态的发现。基于TME中每个细胞的独特进化轨迹，它们在scRNA-seq中以无监督方式与具有相似起源的细胞形成簇，允许研究人员通过观察细胞簇来识别罕见种群，这在传统的 bulk genomics 分析中是不可能的。这种发现与早期经典基本免疫细胞表征的观点形成对比；例如，效应T细胞、 na?ve T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞。许多不同的新型免疫细胞类型已被发现作为这些经典免疫细胞类型的亚群或罕见细胞状态，借助scRNA-seq（表2）。因此，可以实现对TME组成和功能的更全面理解。

肿瘤浸润免疫细胞的作用和类型非常多样化，取决于组织类型和接收到的信号。通过scRNA-seq揭示TME中的罕见免疫细胞类型可以帮助剖析复杂TME，从而扩大治疗开发的选择。一个例子是TME中各种巨噬细胞亚群的发现。TAMs表现出M1和M2激活途径的观点，分别具有抗癌和促癌特性，被广泛接受。而一些巨噬细胞亚群或状态具有超越经典M1/M2表征的潜在治疗意义，被不同研究人员借助scRNA-seq进一步发现。在最近发表的一项研究中，报道了TAMs中巨噬细胞-肌成纤维细胞转变（MMT）的激动人心发现；这始于在NSCLC的scRNA-seq数据集中观察到一个α-SMA⁺巨噬细胞种群。该scRNA-seq数据集的RNA速度和伪时间分析也揭示了CAFs从TAMs通过MMT的发展，为 further study in protumoral TAM or CAF 提供了宝贵见解。同一组更近期的研究发现了另一个罕见巨噬细胞亚集，这是一个通过巨噬细胞向神经元样细胞转变（MNT）发展的神经元样巨噬细胞亚集。首先在小鼠TAM和NSCLC的scRNA-seq数据集中观察到Tubb3⁺巨噬细胞种群；随后的体外和体内研究揭示了这种TAM亚型的神经元表型及其在肿瘤神经支配中的作用。其他组也 uncovered 各种TAM亚群；例如，SPP1⁺巨噬细胞亚集被报道在CRC中通过scRNA-seq是促瘤的。这个SPP1⁺ TAM亚集被显示与传统M1/M2 TAM分类不同，并富集了促血管生成特征基因。在另一项研究中，通过scRNA-seq和质谱流式细胞术在胶质母细胞瘤中识别了一组CD73^hi巨噬细胞。CD73^hi巨噬细胞被显示表现出免疫抑制基因的高表达并抑制T细胞浸润，导致他们发现抗CD73与PD-1和CTLA-4双重阻断的有效组合治疗。除了提到的研究外，一些泛癌scRNA-seq研究也在定义TAM多样性方面提供了宝贵贡献。这些研究中各种TAM亚集的识别，具有超过10种癌症类型的数据集，说明了TAM的全面表型图谱；例如，C1QC⁺ TAMs、LYVE1⁺ TAMs、TREM2 TAMs和IL4I1 TAMs，这些被 suggested 通过不同机制与癌症发展相关。由于借助scRNA-seq识别的新TAM亚集不断出现，数据组织变得至关重要。最近，Ma等人回顾了超过30项关于TAM、TME和TME的scRNA-seq研究。他们提出，这些研究中识别的TAM亚集可以分为七类：干扰素引发的TAMs、免疫调节TAMs、炎症细胞因子富集的TAMs、脂质相关TAMs、促血管生成TAMs、 resident-tissue巨噬细胞样TAMs和增殖TAMs。这些信息可能为未来TAM研究提供见解。

肿瘤浸润T细胞是TME中另一个重要参与者；不同类型的T细胞已被广泛报道与癌症预后显著相关。近年来，许多研究通过scRNA-seq揭示了不同T细胞亚集的存在；已经观察到T细胞组成和多样性在不同癌症类型间 vary。例如，在CRC数据集中识别了一个T细胞亚集，一组CXCL13⁺BHLHE4⁺ T辅助1型（Th1）样细胞，并观察到在微卫星不稳定肿瘤中富集。这个CXCL13⁺BHLHE4⁺ Th1样亚集也被注意到具有 elevated 克隆扩张和增殖。还 suggested 这个亚集与另一个T细胞亚集GZMK⁺效应记忆T细胞之间存在发育联系；因此，这个CXCL13⁺BHLHE4⁺ Th1样亚集可能是一个特定的T细胞发育状态。在另一项研究中，也通过scRNA-seq发现了一个新的T细胞种群；它被称为αβ T细胞受体（TCR）阳性FCER1G表达 innate-like T细胞，具有高细胞毒性潜力（ILTCKs）。这个亚集以Gzmb、Fcer1g和Klrb1c的高表达为特征，这是一个编码NK1.1的基因，NK细胞的表型标记。与常规细胞毒性CD8⁺ T细胞对比，ILTCKs被观察到从不同的祖细胞发展，并表现出更强的抗肿瘤效应。这种发现被 suggested 作为一个潜在治疗选择。在一项肿瘤浸润T细胞的泛癌分析中，通过scRNA-seq揭示了一些T细胞亚集。这项研究中使用的肿瘤浸润T细胞来自300多名患者；一些新发现的T细胞亚集，例如，KIR⁺ NK样T细胞、ZNF683⁺CXCR6⁺组织驻留记忆T细胞和GZMK⁺效应记忆T细胞。用RNA速度进一步分析了T细胞发展；这些T细胞亚集被 suggested 是向T细胞衰竭的过渡状态，这是一种功能减退状态，伴随T细胞效应功能的丧失；换句话说，这是一种抗癌症能力丧失的状态。随着scRNA-seq促进了新型肿瘤浸润T细胞亚集或状态的发现，除了常规T细胞表征外，对这些新发现T细胞的更全面和系统表征变得对 future research in tumour-infiltrating T cells 至关重要。这在Van der Leun等人的工作中得到例证，其中从九项肿瘤浸润T细胞的scRNA-seq研究中总结了这些新发现T细胞，并附有关于功能特征、基因特征、克隆性等信息。

除了巨噬细胞和T细胞外，其他癌症相关免疫细胞的新型亚型或细胞状态也已在近年来通过scRNA-seq识别。一个例子是在NPC中发现CLEC9A⁺ DCs；据报道，CLEC9A⁺ DCs与爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）的DNA水平负相关，EBV已被 suggested 是鼻咽癌发展的 contributing factor。虽然CLEC9A⁺ DCs与EBV相关NPC之间关系的细节尚待阐明，但在另一项研究中，在HCC患者中也发现了一个新的DC亚集。使用scRNA-seq，识别了一个LAMP3⁺ DCs簇；这个DC亚集不属于任何经典DC表征，并被报道具有与T细胞和NK细胞受体相互作用的配体的最高表达，用于调节功能。在一项NSCLC研究中，作者旨在通过scRNA-seq揭示B细胞的多样性，并成功识别了一些新的B细胞亚型，例如，CD20-CD19-CD79A⁺CD79B⁺ B细胞和BCMA⁺ IgG^hi B浆细胞。这些B细胞亚型在NSCLC中的作用被研究，例如，BCMA⁺ IgG^hi B浆细胞在NSCLC晚期促进细胞增殖的能力。

这些发现表明，scRNA-seq使得能够识别TME中广泛的新型免疫细胞亚型（图3），有助于对癌症中免疫景观的更细致理解，并揭示了未来治疗开发的潜在靶点。

4 scRNA-Seq揭示TME的时间动态

TME的动态和异质性 nature 很大程度上归因于高度可塑性和不断演变的肿瘤浸润免疫细胞。现在广泛认识到，这些免疫细胞中的大多数处于瞬态状态而不是离散 developed states。剖析肿瘤浸润免疫细胞的细胞命运提供了对TME更深入和更全面的见解；这可以使用一系列scRNA-seq分析工具来实现，如Monocle、PAGA、Slingshot、RNA velocity等。这些工具旨在阐明细胞的伪时间分析以及轨迹推断，每个都表现出不同的性能和独特的基本原理。

许多研究表明，巨噬细胞是TME中高度可塑性和多才多艺的种群 by scRNA-seq；伪时间和轨迹推断的分析工具已被广泛用于研究TME中巨噬细胞的动态。一个例子是一项肺腺癌巨噬细胞的scRNA-seq研究，其中作者发现了肺泡和间质巨噬细胞的起源。根据Monocle的伪时间分析，大多数间质巨噬细胞被发现起源于血液单核细胞，而肺泡巨噬细胞主要是自我更新的。他们还观察到TAMs中从M1样到M2样表型的发展。在另一项研究中，根据它们的代谢模式研究了肝转移肿瘤中的TAMs。如先前所述，经历MMT和MNT的新型TAM亚集的发现是显示TAM异质性的例子。研究小组利用Monocle和RNA velocity来说明，新型肌成纤维细胞样和神经元样巨噬细胞是在TME分泌的特定因素刺激下从巨噬细胞衍生的。

TME中另一个高度丰富和异质的免疫细胞类型是T细胞；许多研究表明，衰竭T细胞在TME中常见且对癌症进展重要。通过采用scRNA-seq和伪时间分析，Guo等人说明了NSCLC中T细胞的发育途径。他们显示 na?ve T细胞分成两个不同的CD8⁺ T细胞轨迹，由Monocle components of T细胞衰竭和细胞毒性获得代表。CD4⁺ T细胞的发育轨迹也被分析，显示向效应T细胞和具有T滤泡辅助样特征的衰竭T细胞的分支发展。在另一项肺腺癌的scRNA-seq研究中，CD8⁺ T细胞的发育轨迹被显示与Guo等人的研究相似。观察到三个代表不同状态的不同分支： na?ve、细胞毒性和衰竭，每个Monocle component与细胞毒性和衰竭相关。在伪时间晚期衰竭T细胞的富集观察不仅在这些肺癌研究中，而且通过伪时间分析在其他癌症中也观察到。

伪时间分析工具也被广泛用于推断其他TME成分的发育途径。例如，RNA velocity和Monocle分析被用来说明Smad3在N1/N2状态中性粒细胞极化中的作用，由N2发育途径中富集的Smad3表达指示；在Smad3敲除（KO）中性粒细胞中观察到N1发展。另一个例子是一项乳腺癌中髓源性抑制细胞（MDSCs）的研究；MDSCs是一组 alternatively activated 未成熟免疫细胞，具有强免疫抑制活性。已经 suggested，阐明它们的发育机制可能对开发逆转它们免疫抑制活动的治疗策略有用。从乳腺癌 bearing 小鼠脾脏分离的MDSCs的scRNA-seq揭示了MDSCs及其正常对应物、中性粒细胞和单核细胞的不同簇。采用伪时间分析进一步阐明粒细胞-MDSCs（G-MDSCs）的发展；显示G-MDSCs和中性粒细胞通过从中性粒细胞祖细胞的不同发育途径出现，由Monocle生成的三分支轨迹代表。

5 scRNA-Seq揭示涉及TME的细胞间相互作用

沿着从 pre-malignant 状态到恶性状态甚至转移的癌症进展过程，细胞-细胞相互作用是这种进展的基本要素。这种相互作用是如此多样化，它们包括 pre-malignant 细胞、恶性细胞以及非恶性细胞的参与，包括但不限于免疫细胞。TME的高度异质性诱导了高度复杂的相互作用网络的形成；这是由各种细胞相互作用驱动的，如配体-受体相互作用和旁分泌信号。在癌症进展期间发生的许多事件依赖于这些细胞间通讯；因此，对这种复杂相互作用网络的更深入理解可能为开发新的治疗机会提供新见解。这种细胞相互作用的分析得益于scRNA-seq的出现，由于发展了用于推断细胞间相互作用的分析方法。一些 well-known 这些工具的例子包括CellPhone DB、CellChat和NicheNet，这些在最近的研究中都被常用。还有许多其他类似工具可用于研究使用；一般来说，所有这些工具都由两个主要组件组成：一个具有配体-受体相互作用先验知识的数据库和一个基于从scRNA-seq数据获得的配体或受体表达估计细胞间相互作用的预测