基于TurboID邻近标记技术解析胰腺肿瘤中KCa3.1钾通道互作组及其信号通路的新机制

本文利用TurboID邻近标记技术系统鉴定了胰腺导管腺癌（PDAC）中钙激活钾通道KCa3.1的相互作用蛋白组，揭示了其在膜转运、细胞骨架重塑、线粒体功能及免疫微环境调控中的多重作用，为靶向KCa3.1及其互作网络的胰腺癌治疗策略提供了新见解。

　　

1 引言

K_Ca3.1（又称IK1或SK4）是由KCNN4基因编码的钙激活电压非依赖性钾通道，其电导值在150 mM KCl中可达90 pS。该通道以异源四聚体形式存在，可被亚微摩尔浓度的胞内钙激活，引起膜超极化，进而激活TRPV通道和CRAC通道，增强钙内流。K_Ca3.1在多种癌细胞和免疫细胞中表达，参与增殖和迁移的调控。此外，该通道还定位于线粒体内膜，参与钾离子跨膜流动，稳定线粒体膜电位（ΔΨ_m），调控氧化磷酸化（OXPHOS）和活性氧（ROS）产生，影响肿瘤进展和化疗抵抗。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，K_Ca3.1表达上调，通过MET介导的AKT信号通路驱动肿瘤进展和转移，其抑制可诱导凋亡和细胞周期阻滞。然而，K_Ca3.1在癌细胞中的信号通路分子细节尚未完全阐明。

2 材料与方法

研究采用KPCY小鼠PDAC细胞系（模拟人PDAC的侵袭转移行为），通过Tet-On诱导系统表达K_Ca3.1-FLAG-TurboID融合蛋白，利用TurboID介导的邻近生物素标记技术，在活细胞中对K_Ca3.1的相互作用蛋白进行标记。生物素化蛋白经链霉亲和素珠富集后，通过TMT标记的定量质谱分析鉴定互作蛋白。数据经limma包进行差异分析（FDR<0.05，FC>1.5），并通过GO、KEGG和Reactome数据库进行功能富集分析。互作关系通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光技术验证。此外，利用TCGA、GTEx等公共数据库分析KCNN4表达与临床特征、突变状态及免疫浸润的相关性。

3 结果

3.1 K_Ca3.1互作组的鉴定

通过TurboID邻近标记技术，在KPCY细胞中成功鉴定出283个K_Ca3.1特异性互作蛋白。Western blot和PCR验证了诱导表达和生物素化效率。火山图显示多个显著富集的蛋白（log2FC>0.58，p<0.05），包括参与细胞粘附、细胞骨架、信号转导和囊泡运输的分子。

3.2 互作蛋白的功能富集分析

GO分析显示，互作蛋白显著富集于分子功能（如磷酸酶结合、钙黏蛋白结合、肌动蛋白丝结合）、细胞组分（如膜筏、紧密连接、线粒体）和生物过程（如肌动蛋白组织、小GTP酶信号调控、蛋白膜定位）。KEGG通路分析揭示K_Ca3.1参与内吞作用、粘附连接、RAP1信号和钙信号通路。互作网络包括多个膜相关蛋白（如ITGB4、STIM1）、线粒体蛋白（如SUCLA2、IARS2）及信号分子（如MET、TSG101）。

3.3 互作蛋白的生化验证

免疫荧光证实K_Ca3.1定位于质膜和线粒体（与TOMM20共定位）。Co-IP验证了K_Ca3.1与STIM1的相互作用，且该互作在SOCE激活条件下稳定存在。此外，K_Ca3.1与整合素β4（ITGB4）的互作得到证实，两者表达在PDAC中显著正相关（R=0.6，p<0.0001）。过表达K_Ca3.1诱导细胞骨架重塑，形成多个丝状伪足和应力纤维。

3.4 KCNN4在胰腺癌中的表达与临床意义

TCGA数据分析显示，KCNN4在PDAC肿瘤组织中表达显著高于正常组织（p<3.36e-26），且在淋巴结转移（N1）和晚期（Stage 4）肿瘤中进一步上调。生存分析表明，KCNN4高表达与不良预后相关（HR=1.31，p=0.0117）。KCNN4表达与KRAS（p=3.5e-16）和TP53突变（p<10-11）正相关，与CDKN2A突变亦相关（p=2.1e-05）。免疫浸润分析显示，KCNN4与Tregs、M0巨噬细胞正相关，与CD8⁺ T细胞、NK细胞负相关，提示其参与免疫抑制微环境的形成。

4 讨论

4.1 K_Ca3.1互作组的特征

本研究首次在PDAC细胞中系统绘制了K_Ca3.1的邻近蛋白网络，鉴定出283个互作蛋白，其中6个（CDH1、DISP1、SCFD1、USE1、TSG101、USP8）与BioGRID数据库已知互作蛋白重叠，验证了方法的可靠性。未检测到某些已知互作蛋白（如CFTR、PMCA4b），可能源于细胞类型特异性或技术差异。

4.2 线粒体互作蛋白的功能启示

K_Ca3.1与线粒体蛋白（FKBP8、AHCYL1、STOM、SFXN3等）的互作提示其参与线粒体自噬、离子转运和代谢调节，但需进一步验证互作强度及功能影响。

4.3 癌症相关互作蛋白的病理意义

MET作为K_Ca3.1的新互作蛋白，两者表达显著相关（R=0.41），证实K_Ca3.1通过钙信号调控MET/AKT通路促进PDAC进展。与ITGB4和STIM1的互作揭示了K_Ca3.1在细胞粘附、钙稳态和骨架重塑中的核心作用，为靶向干预提供了新靶点。

4.4 临床与免疫微环境关联

KCNN4高表达与KRAS/TP53突变、晚期肿瘤和免疫抑制表型相关，凸显其作为预后标志和治疗靶点的潜力。其与免疫检查点分子（如PD-L1、TIM-3）的正相关进一步支持了其在免疫逃逸中的作用。

本研究通过多组学整合分析，深入揭示了K_Ca3.1在PDAC中的多层面功能，为开发针对K_Ca3.1及其互作网络的精准治疗策略奠定了理论基础。